亮氨酸通过调控mTOR影响感染PEDV猪肠道TLRs/NF-κB炎性通路研究

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) destroyes intestinal mucosal immune response of piglets through TLRs/NF-κB signaling pathway. As involved in TLRs/NF-κB signaling pathway, the role of mTOR in innate immune response triggered by PEDV is not well known. In this study, the weaning piglets and IPEC-J2 cells will be used as in vitro and vivo models respectively, by using experimental techniques of transmission electron microscope, flow cytometry, quantitative real-time PCR, Western Blot, ELISA as well as immunohistochemical analysis. Firstly, a specific inhibitor of mTOR, rapamycin will be used to determine the effects of mTOR activity control in the intestinal immunization barrier and TLRs/NF-κB pathway. Furthermore, we will clarify the mechanisms involved in mTOR, TLRs/NF-κB and GCN2 signaling pathways of mucosal inflammatory regulation in the model of intestinal porcine epithelial cell line IPEC-J2 in vitro induced by Leucine. Finally, we test the hypothesis that mTOR activity control may have an important role in the function of intestinal immune response in the model of piglets. The aim of this study is to provide an effective nutritional method to prevent and control PEDV triggered intestinal disease.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪损伤肠道免疫屏障功能，通过影响TLRs/NF-κB途径调控免疫应答反应。mTOR作为参与TLRs/NF-κB炎性调控的重要位点，在PEDV逃避宿主天然免疫反应中的作用及其机制尚不清楚。鉴于此，本项目分别以断奶仔猪和IPEC-J2细胞为体内外试验模型，结合透射电镜、流式细胞、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化、ELISA等技术，应用mTOR特异性抑制剂——雷帕霉素（Rapamycin），研究mTOR在PEDV诱导猪肠道免疫屏障及TLRs/NF-κB炎性通路中的作用；结合细胞内mTOR、TLRs/NF-κB和GCN2信号通路，进一步探讨亮氨酸（Leu）调节PEDV诱导猪肠道炎性反应的细胞内分子机制；通过饲养试验最终验证mTOR活性调控对仔猪肠道黏膜免疫屏障功能的影响，为生产上预防和控制因PEDV感染引起仔猪肠道疾病提供有效的营养调控措施。

新生仔猪作为猪流行性腹泻病毒（PEDV）的易感群体，感染后引发严重腹泻和脱水，因高发病率和死亡率造成巨大的经济损失，严重影响了养猪业的发展，并随规模化养殖水平的提高，该病的爆发程度逐年递增。目前，通过母猪主动免疫是预防和控制仔猪感染PEDV最为有效的兽医手段，但疫苗制作成本较高，使用效果不稳定，存在一定的安全隐患。因此，在健康、安全和高效的养猪生产模式下，有必要寻找一种安全、有效的防控PEDV的营养调控措施。本项目研究结果表明：PEDV感染仔猪能够引起仔猪肠道损伤，其治病机理在于破坏猪小肠粘膜，引起肠道粘膜上皮屏障功能受损。PEDV诱导炎症反应的作用机制主要通过激活RLR和TLR，进一步激活NF-kB，诱导细胞因子及干扰素表达。具体表现为：PEDV感染IPEC-J2细胞36小时，通过上调TLRs（TLR2、TLR3、TLR9、MyD88、TRIF）和RLRs（RIG-I、MDA5、MAVS、STING）信号通路，进一步诱导细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β、IFN-λ）的产生。研究证明：mTOR作为参与NF-kB炎性调控的重要位点，在PEDV逃离宿主天然免疫反应中发挥重要作用。mTOR抑制后下调TLR3、RIG-I、MDA5信号通路，降低NF-kB活性及下游细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β、IFN-α、IFN-β及IFN-λ的mRNA表达。Leu下调TLR2、TRIF和MAVS的表达，抑制NF-kB活性，调控细胞因子TNF-α和IL-10的表达，缓解PEDV对IPEC-J2细胞增殖的抑制作用，提高宿主抵抗病毒的能力。研究表明：Leu缓解PEDV诱导IPEC-J2细胞产生炎症反应的机制与Leu激活mTOR有关。通过饲粮中添加Leu可以达到缓解PEDV损伤肠道屏障功能的目的为预防及治疗PEDV感染对仔猪肠道屏障功能的影响提供理论依据。