2'-5' OAS启动子调控的重组caspase-3质粒在体内特异性诱导HCV感染肝细胞凋亡及提高机体免疫应答的实验研究

In a previous study, we constructed a recombinant caspase-3 expression vector under the 2'-5'-oligoadenylate synthetase gene (OAS) promoter (pGL3-OAS-re-caspase-3) and demonstrated that it can specifically induce apoptosis in hepatocytes in vitro and in transplantation tumor, which express HCV core protein. To confirm further in vivo that pGL3-OAS-re-caspase-3 can specifically induce apoptosis in HCV-infected hepatocytes, and simultaneously improve immune response to HCV through antigen presenting cells phagocytizing apoptotic hepatocytes, tree shrews will be used to build small animal models with HCV infection. pGL3-OAS-re-caspase-3 coated with galactosylated chitosan-graft low molecular polyethyleneimine will be introduced into hepatocytes of the tree shrews. Then apoptosis of HCV-infected hepatocytes, pathological change of liver tissue, HCV content in serum and liver tissue, changes of hepatic function and extracellular matrix and immune response to HCV will be detected. We hope that a novel strategy will be developed for specific hepatitis C therapy.

在前期研究中我们利用HCV核心蛋白能特异性激活2'-5'寡核苷酸合成酶启动子的特性，使重组活化的Caspase-3基因处于2'-5'寡核苷酸合成酶基因启动子调控下，构建了HCV特异性Caspase-3质粒（pGL3-OAS-re-caspase-3），该质粒能在体外和体内移植瘤模型中特异性地诱导表达HCV核心蛋白的细胞凋亡。为进一步证实该质粒能在HCV感染的小动物模型中特异性诱导HCV感染的肝细胞凋亡，同时又能通过抗原提呈细胞吞噬凋亡肝细胞提高机体对HCV的免疫应答，达到清除病毒的目的。本项目拟以树鼩制备HCV感染的小动物模型，pGL3-OAS-re-caspase-3以半乳糖化壳聚糖-聚乙烯亚胺包被，将其特异性导入肝细胞，检测HCV感染肝细胞的凋亡、肝组织的病理变化、血清及肝组织中HCV含量、肝功能和细胞外基质表达的变化以及机体对HCV的免疫应答，以期发展一种特异性的丙型肝炎治疗新策略。

实验设计中，由于未考虑到OAS 最早被发现时因受IFN 调控而命名为IFN 调控基因，因此OAS 不仅受Core 蛋白调控，同时也受IFN 调控。为了证实IFN是否调控Pgl3- OAS- re- caspase-3质粒诱导细胞凋亡，我们首先将PGL3-OAS-re-caspase-3质粒上启动子和目的基因片段OAS-re-caspase-3拼接到载体GV230上，构建了质粒EGFP-OAS-re-caspase-3，将质粒EGFP-OAS-re-caspase-3和空白EGFP质粒分别转染肝细胞系L02，建立稳定转染细胞系（HL7702/EGFP-OAS-re-caspase-3和HL7702/EGFP），然后在培养体系中加入不同浓度的IFN，流式细胞术检测细胞凋亡；同时，将质粒EGFP-OAS-re-caspase-3和空白EGFP质粒分别转染肝癌细胞系HepG2，并建立稳定转染细胞系（HepG2/EGFP-OAS-re-caspase-3和HepG2/EGFP），接种裸鼠形成移植瘤，瘤内注射IFN，通过TUNEL检测癌组织内细胞凋亡数；结果显示，IFN在体外和体内均能明显诱导EGFP/OAS-re-caspase-3质粒转染的细胞凋亡。故利用OAS作为重组caspase-3基因的启动，内源性和外源性干扰素有可能会激活OAS促使重组caspase-3基因表达，诱导未感染HCV的肝细胞凋亡，因此，该项目要达到预期目的还需进一步改进质粒的启动子。此外，我们还利用HCV培养体系上清和HCV感染患者血清中获得了高滴度HCV病毒颗粒，为制备HCV感染小动物模型提供了必备的实验材料。