RNA解旋酶Prp5的翻译后修饰及其调控剪接机制研究

Pre-mRNA splicing, excision of introns from coding genes, is one of the essential steps during the eukaryotic gene expression and regulation. RNA splicing is catalyzed by a large dynamic RNA-protein complex, the spliceosome, which requires numerous conformational changes during its assembly and catalysis. It has been proposed that RNA helicases (or ATPases) are responsible for facilitating these conformational changes to rearrange interactions in spliceosome. Post-translational modifications (PTM) diversify the functions of proteins and have been proved to be important in cell signal transduction. Prp5, an RNA helicase, facilitates pre-spliceosome assembly and modulate splicing fidelity. In this project, we will focus on the post-modification of Prp5 in human cell lines and investigate its regulation on RNA splicing. Firstly, the PTM sites in Prp5 will be identified by co-purification and mass spectrum analysis. Secondly, we will search the modification enzymes of Prp5 and confirm their interactions. Lastly, the influence of Prp5’s modifications to RNA splicing will be further addressed using mutagenesis and splicing reporter assays. This project will be helpful to elucidate a regulatory mechanism of RNA splicing efficiency and fidelity by modification of an RNA helicase responding to cell signaling.

Pre-mRNA剪接将编码基因中的内含子去除，是真核生物基因表达调控中的重要环节。RNA 剪接由剪接体催化完成，其组装和催化过程中涉及到一系列RNA-RNA，RNA-蛋白质间相互作用的改变与构象变化，主要由一类RNA解旋酶促进完成。翻译后修饰是蛋白质实现功能多样性的重要方式，也是信号传导途径中的重要调控手段。Prp5是一种RNA解旋酶，具有促进预剪接体组装和调控剪接保真性作用，但翻译后修饰对Prp5功能的精细调控尚未有研究。本项目对人类细胞中Prp5的翻译后修饰展开研究，计划首先通过蛋白质分离纯化和质谱鉴定获得Prp5的修饰位点与修饰种类，然后筛选和鉴定其上游的修饰酶，确定酶与底物的相互作用。最后通过突变体与体内、体外剪接系统检测，研究这些修饰对Prp5的活力与RNA剪接效率的影响，希望由此阐明信号传导途径控制的Prp5翻译后修饰在高等生物中调控RNA剪接效率与保真性的分子机制。

RNA剪接是转录后加工的重要步骤，而RNA解旋酶是剪接体组装与催化的重要组份，其中Prp5参与内含子识别与早期剪接体形成，维持剪接的保真性。本项目试图研究Prp5是否通过翻译后修饰来调节自身活力，从而参与保真性调控。1）采用基因组编辑技术构建了多个细胞系，通过免疫共沉淀和质谱鉴定了包括磷酸化在内的hPrp5多个翻译后修饰位点；2）以S804位点的磷酸化为研究对象，制备了特异性识别磷酸化的多抗，通过磷酸酶处理和突变体实验证明该磷酸化修饰的真实性，并研究了突变体对报告基因剪接的影响；3)构建了S804A突变细胞系，进一步的转录组测序分析发现细胞中大量的选择性剪接事件发生变化。相对于野生型，突变体细胞系中外显子跳读和内含子保留程度加重的事件在所有变化类型中所占比例最高，说明S804位点的磷酸化促进了RNA剪接的发生，初步揭示了S804位点磷酸化调控选择性剪接发生的机制。4) 体外实验揭示CK2可能是S804磷酸化的上游激酶。这些研究结果为进一步深入开展高等生物中各种信号传导通路对剪接体组份的修饰和随之的RNA剪接精细调控研究提供了新的思路。