脉络丛细胞移植对脑出血后早期脑损伤修复的实验研究

脑出血（ICH）是严重危害人类健康的常见病和多发病，高致残率给社会和家庭带来了巨大的负担，而目前对ICH后神经功能损害尚无确切有效的治疗手段。由于ICH后早期脑损伤发生神经细胞损害和脑微环境改变，故采用脑细胞移植可作为一种治疗ICH后神经功能缺失的有效方法。脉络丛是隐藏在脑室内较小而重要的解剖结构，它不仅能合成和分泌内源性神经营养因子，而且还存有干细胞及分化成星形胶质细胞的能力。脉络丛细胞通过自身合成和分泌内源性神经营养因子以改变局部脑微环境，从而有助于神经轴突的再生和中枢神经损伤的修复，有望成为一种新的神经修复方法，但脉络丛细胞移植治疗ICH至今一直未见报道。本课题通过对脉络丛细胞的原代培养和微囊技术包裹，以脉络丛细胞作为种子细胞替代缺失的神经细胞，重建受损的神经通路，改善局部脑微环境，观察脉络丛细胞能否促进ICH后早期脑损伤神经功能的恢复，为ICH采用脉络丛细胞移植治疗提供实验依据。

目的 探索脉络丛细胞移植治疗脑出血的可行性，为今后采用脉络丛上皮细胞移植治疗脑出血后早期脑损伤提供实验基础和理论依据。方法 1. 采用机械分散法获取脉络丛上皮细胞，对原代培养的细胞进行活体形态观察和细胞鉴定，并对脉络丛上皮细胞进行巢蛋白（nestin）表达检测。2. 应用高压静电成囊装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸（APA）微囊。考察不同的物理参数、化学参数对微囊质量的影响，最终摸索最适合的制备条件。3. 将脉络丛上皮细胞进行微囊化及微囊化后冻存、复苏。通过酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法比较脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）分泌量的变化，以综合评价微囊化及微囊化后超低温冻存对细胞生物活性的影响。4. 采用胶原酶诱导法建立大鼠脑出血模型，1天及7天后利用Bederson评分和平衡木行走试验对动物模型进行神经行为学评分并进行血肿体积测定。5. 对大鼠脑血肿腔行微囊化细胞、未微囊化细胞移植，2周后进行神经行为学评分、脑电图检测和血肿体积测定。结果 1. 脉络丛上皮细胞生长良好，电子显微镜显示脉络丛上皮细胞有大量的微绒毛和粗面内质网，免疫荧光组织化学法显示TTR的大量表达以及巢蛋白的少量表达。2. 制备微囊时室温在18-20℃，最佳海藻酸钠浓度为1.8%，最适液面高度为23-25mm，电压为4×104V。微囊呈大小均一圆球形，直径为312±35μm。3. 细胞接种后第1-4天，微囊化组BDNF、GDNF分泌量高于微囊化冻存组，但低于对照组，三组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。接种5天后，三组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4. 大鼠脑出血模型制作7天后神经功能学评分为6.300±0.483，血肿体积为42.37±2.00μl。5. 细胞移植后2周，微囊化细胞组和未微囊化细胞组大鼠神经功能学评分、脑电图检测和血肿体积测定比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而微囊化细胞组和未微囊化细胞组分别与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 首次成功采用机械分散法培养出高纯度的脉络丛细胞，并证实微囊化脉络丛上皮细胞早期移植可显著改善脑出血大鼠的神经功能缺失。该研究结果初步表明脉络丛细胞移植在脑出血后早期神经功能修复中的治疗作用，对于深入开展脑出血后早期神经功能修复具有重要的理论和实用价值。