具有诱导活性的聚谷氨酸基软骨组织工程支架研究

组织工程为临床修复软骨缺损提供一种新的治疗方法。本项目拟通过活化接枝手段将生长因子骨形态蛋白（BMP）引入到聚谷氨酸中，以聚谷氨酸-g-BMP为主体材料，通过原位静电络合和活化交联法分别构建具有诱导效应、细胞黏附性良好、力学性能优良、支架降解与组织再生相匹配的聚谷氨酸-g-BMP/壳聚糖/胶原软骨组织工程复合支架。揭示复合支架组成及结构与力学性能、降解性能和生物性能关系，对软骨细胞和骨髓间充质干细胞在材料上的黏附与增殖进行定性、定量评价，探索接枝BMP诱导骨髓间充质干细胞成软骨效应，同时利用构建的细胞-支架复合物进行兔关节软骨缺损修复实验，并利用组织学、免疫酶联等方法检测修复效果。本课题通过接枝方法解决生长因子进入体内后弥散、降解而导致的利用率低问题，原位静电络合和活化交联法保证制备结构和性能均一的复合支架，聚谷氨酸和壳聚糖的水溶性有利于胶原和生长因子的引入。

本研究从聚L-谷氨酸苄酯（PBLG）、聚L-谷氨酸（PLGA）的放大合成开始，以乙二胺，二正己胺，二环己基胺和三乙胺作为引发剂引发γ-苄基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐（BLG NCA）的开环聚合合成PBLG。通过对L929成纤维原细胞的培养和MTT法研究， 证实PBLG和PLGA具有良好的生物相容性。. PLGA功能化获得具有调节细胞行为的PLGA嵌段共聚物。本研究合成了聚丙烯酸-聚L-谷氨酸(PAA-PLGA) 和聚乙二醇-聚L-谷氨酸（PEG-PLGA）嵌段共聚物，并在聚乳酸（PLA）表面层层自组装PLGA及其嵌段共聚物与CS聚电解质多层膜，研究结果表明组装PLGA聚电解质多层膜能促进细胞在PLA表面的粘附与增殖。与PLGA相比，PAA-PLGA 可进一步提高细胞粘附性，但是细胞增殖能力有所降低。PEG-PLGA对细胞具有抗粘附作用。. 在这些工作基础上，本研究利用PLGA的羧基和CS氨基的静电作用，构建出PLGA和CS的聚电解质复合物，经过冷冻干燥得到一种多孔材料。从组成成分和组分相互作用角度模拟细胞外基质，获得本身具有调节细胞分化和组织发生作用的诱导活性材料。为探索该材料在组织工程中的应用，研究了脂肪干细胞在材料上的体外粘附、扩增和分化，并对兔关节软骨缺损进行了修复。12周后体内良好的修复效果表明，PLGA/CS聚电解质支架具有诱导活性。. 为进一步模拟脂肪干细胞向软骨分化所需三维微团体系， 以NHS和EDC为活化剂活化PLGA的羧基，再与CS反应制备了PLGA/CS化学交联水凝胶，经过冷冻干燥得到支架材料，该材料能模拟软骨细胞天然的生长环境，支持细胞成团培养，具有明显的诱导活性。研究表明该支架更利于脂肪干细胞向软骨细胞分化。. 最后探索制备了多孔PLGA/CS微载体。以平均粒径为47.5±5.4μm的壳聚糖多孔微载体为模板，将其浸泡在37℃下PLGA溶液中，通过静电作用组装形成PLGA/CS微载体。与壳聚糖微载体比较，PLGA/CS多孔微载体能有效地促进细胞黏附和增殖。将微载体植入皮下8周后，发现载有软骨细胞的PLGA/CS微载体比CS微载体产生更多的软骨基质。 结果表明PLGA/CS微载体可以作为软骨再生的可注射细胞载体。