宿主IFITM3蛋白精氨酸甲基化修饰调节抗流感病毒作用研究

Interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) is a protein that is critical for anti-viral infection in host immunity. Cysteine palmitoylation, lysine ubiquitination, lysine methylation and tyrosine phosphorylation of IFITM3 play important roles in regulating its function of anti-influenza virus. Our previous work found that there was interaction between the protein-arginine methyltransferase (PRMT7) and IFITM3, this interaction resulted in methylation modification of IFITM3 arginine residues and downregulated its anti-influenza virus effect. To explore the specific role and mechanism of PRMT7/IFITM3 interaction in regulating influenza virus infection, in this study, we will firstly clarify the kinetics and form of methylation modification of IFITM3 arginine in influenza virus infection by means of Co-IP, laser confocal imaging, mass spectrometry, in vitro methylation, gene silencing and flow cytometry, and further elucidate how this modification affects the molecular mechanism of IFITM3-mediated anti-influenza virus function. Thus, the important function of PRMT7/IFITM3 interaction in regulating influenza virus infection would be clarified.

干扰素诱导的跨膜蛋白3（Interferon-induced transmembrane protein 3，IFITM3）是宿主免疫应答中重要的抗病毒感染蛋白，该蛋白的半胱氨酸棕榈酰化、赖氨酸泛素化、赖氨酸甲基化及酪氨酸磷酸化修饰对其抗流感病毒功能起着重要的调节。我们前期工作发现精氨酸甲基化酶PRMT7与IFITM3存在相互作用，并引起IFITM3精氨酸残基发生甲基化修饰，下调了IFITM3的抗流感病毒感染作用。为探明PRMT7/IFITM3在调控流感病毒感染过程中的具体作用及机制，本课题将利用Co-IP、激光共聚焦、质谱鉴定、体外甲基化、基因沉默和细胞流式等实验手段，首先明确流感病毒感染中IFITM3蛋白精氨酸发生甲基化修饰的动力学和形式，并进一步解析该修饰如何影响IFITM3介导的抗流感病毒功能的分子机制，从而阐明PRMT7/IFITM3在调控流感病毒感染过程中发挥的重要功能。

干扰素诱导的跨膜蛋白3 (IFITM3)是IFITM家族的重要成员，但是其抗病毒作用的分子机制尚未完全阐明。目前对IFITM3的研究主要集中于其先天性抗病毒反应的机制研究，最近的研究表明IFITM3也可影响机体适应性免疫反应。为了明确IFITM3蛋白在机体内抵抗流感病毒感染中的作用。我们运用蛋白质组学、流式细胞术、免疫组化分析和生物信息学分析，系统地比较和分析在流感病毒感染不同天数的Ifitm3-/-和野生型小鼠肺脏中自然杀伤(NK)细胞的差异，包括数量、激活状态及其免疫功能。结果显示相对于野生型小鼠，Ifitm3-/-小鼠的炎症和凋亡反应更严重。此外，在急性感染期Ifitm3-/-小鼠的肺中NK细胞活化比例更高。基于目前的结果我们推测内源性缺乏IFITM3的NK细胞更容易被激活，增加Ifitm3-/-小鼠的死亡率。.IFITM3作为分子量很小的蛋白，本身缺乏明显的酶活区域，表明其抗病毒功能需要细胞内协同因子的参与。通过免疫沉淀-质谱鉴定IFITM3潜在的相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀实验验证PRMT7是IFITM3的相互作用蛋白。而且我们的研究发现PRMT7抑制流感病毒的复制，并且依赖于其甲基转移酶的活性。IFITM3存在精氨酸单甲基化，由PRMT7介导。IFITM3仅有的3个精氨酸中的第85和87位精氨酸在进化上非常保守，符合“RxR”序列特征基序，通过外源性突变质粒表达的甲基化检测表明IFITM3单甲基化修饰位点是第85和87位精氨酸。IFITM3精氨酸甲基化修饰影响其抗流感病毒的能力。.鉴于尚无PRMT7参与调控流感病毒复制的报道，为了进一步探索其参与抗病毒反应的机制研究，通过免疫沉淀-质谱鉴定PRMT7潜在更多的底物蛋白。经过验证我们发现DDX3X与PRMT7存在相互作用，而且DDX3X存在单甲基化修饰。但是DDX3X具有55个精氨酸，因此我们借助GPS-MSP-Methyl-group Specific Predictor 1.0 网站进行了预测，得到9个潜在的精氨酸单甲基化位点，并且通过细胞转染过表达点突变质粒的方法，初步得到几个潜在的甲基化修饰位点。下一步需要通过体外表达纯化蛋白进行pull-down和体外甲基化反应，证明其甲基化修饰位点。并通过内源性敲除A549细胞和肺上皮条件性PRMT7敲除小鼠进行功能实验验证和分子机制的探索研究。