应力作用下NF-κB信号通路介导牙囊细胞调节自噬诱导破骨细胞分化的研究

The mechanism of dental eruption disorder under mechanical stress has long been a hot topic in dental research. As an important cell population in tooth eruption, dental follicle is supposed to play a vital role in osteoclast differentiation and eruption pathway formation. Our preliminary studies indicate that mechanical stress and NF-κB signal pathway maybe correlated with tooth eruption. However, the exact role and related molecular mechanism remains unknown. Another study has hinted that NF-κB inhibitor triggers cell differentiation may be related with arrests cell cycle and promotes autophagy activation. Consequently, our project proposes that dental follicle under mechanical stress influence dental eruption may be mediated by NF-κB signal pathway and autophagy. To verify the above assumptions, we intend to means of cell culture and mechanical loading model of dental follicle as well as animal model of failure of tooth eruption. Then adding deactivation of NF-κB signal pathway and autophagy study in vitro and in vivo, and explore the mechanism of NF-κB signal pathway mediates dental follicle to induce osteoclast differentiation via autophagy under mechanical stress, which will be benefit to offer new theoretical and experimental evidences for the prevention and management of dental eruption disorder.

应力作用下牙齿萌出障碍的发生机制一直是国内外口腔学者着力研究的热点。牙囊作为牙齿萌出的必要器官，在诱导破骨细胞分化、促进萌出通道形成方面具有重要作用。我们前期研究发现牙齿萌出时的压力和NF-κB信号通路可能与牙囊细胞诱导破骨细胞分化密切相关，然而其确切作用及相关分子调控机制不甚清楚。另有研究提示NF-κB抑制剂触发细胞分化的机制可能和抑制细胞周期、激活自噬有关。因此我们提出假设：牙囊细胞可能在萌出压力作用下，通过NF-κB信号通路和自噬诱导破骨细胞分化，调节牙齿萌出通道的形成。为验证上述假设，本项目拟体外建立牙囊细胞培养-应力加载模型和牙齿萌出障碍动物模型，通过阻断信号通路和阻断自噬的方法进行体外和体内研究，从分子水平上阐明应力、NF-κB信号通路和自噬在牙囊细胞诱导破骨细胞分化过程中的调控机制，进而为牙齿萌出异常的防治提供新的理论和实验依据。

课题组在前期的研究中按照实验设计进行牙囊细胞的培养，然而在实验进行中发现牙囊细胞无法满足要求，首先牙囊细胞体外培养数目较少，另外牙囊细胞是一种异质性的细胞群体，细胞形态随着培养时间而变化多样，从而影响实验结果的判定。由于客观条件的限制，课题组未能继续围绕牙囊在牙齿萌出过程中的信号通路和自噬间的关系进行更深研究。.由于课题研究目的是观察NF-κB信号通路和自噬在牙齿萌出过程中的作用机制。因此当牙囊细胞不能满足实验要求时，我们选用与牙齿萌出密切相关的另一细胞--成骨细胞进行相应研究。目前已经认识到在破骨细胞发育、分化过程中成骨细胞/ 间质细胞（OB/ST）与前破骨细胞之间的相互作用至关重要,其纽带正是表达于OB/ST膜上的RANKL和表达于前破骨细胞膜上的RANK这一对配体受体的结合。上述的论述我们可以看出本课题最初选用的牙囊细胞（间质细胞的一种）换成成骨细胞对于整个实验研究不会产生本质的影响。将情况上报国家基金委，同意按照现方案继续进行相关研究。而后项目负责人围绕成骨细胞在牙齿萌出过程中的作用及相关分子调控机制展开卓有成效的研究，并着重研究了NF-κB信号通路和自噬在成骨细胞对破骨细胞分化命运的调控作用。.我们通过慢病毒转染，成功构建靶向Runx2基因的成骨细胞慢病毒载体。而后对Runx2基因沉默的成骨细胞进行功能学研究，结果提示Runx2可能通过NF-κB通路和自噬的方式调节成骨细胞的分化。进一步通过NF-κB通路阻断剂SN50加入体外培养的细胞中观察自噬情况，研究提示成骨细胞本身具有较强的自噬作用，且NF-κB通路阻断剂SN50在25ug/ml浓度，24小时时对成骨细胞自噬功能产生明显影响，从而筛选出了SN50最合适的作用浓度和时间。同时对Periostein基因沉默的成骨细胞进行Runx2蛋白检测，发现Runx2蛋白表达下降，提示Runx2和Periostein可能存在一个协同关系。本课题初步探讨了Runx2、Periostein、NF-κB通路和自噬间的相互关系以及它们在成骨细胞分化中可能调控机制，为译解牙齿萌出障碍的病因和防治提供新的实验依据。