基于肝细胞来源的细胞外囊泡CD40L介导巨噬细胞活化研究鹿仙草多糖改善酒精性肝炎的作用机制

The excessive activation of intrahepatic macrophages plays an important role in the pathogenesis of alcoholic hepatitis. Inhibiting the activation of hepatocytes to macrophages can alleviate inflammation and protect alcoholic hepatitis. Recent studies have shown that alcohol stimulates macrophage activation through caspase-3/ROCK1 axis dependent hepatocyte derived release of CD40L containing extracellular vesicles (EV), which is also one of the important mechanisms of excessive activation of macrophages in alcoholic hepatitis. Our previous studies have confirmed, that the total polysaccharides extracted from Balanophora henryi hemsl.(TBP) had a good hepatoprotective effects on on mice with alcoholic hepatitis through inhibiting the activation of intrahepatic macrophages. Preliminary experiments suggest the effects were related to EV associated CD40L. Therefore, we speculate that TBP can protect alcoholic hepatitis by regulating the caspase-3/ROCK1 axis to inhibit the activation of macrophages. This project intends to further study the pharmacological mechanism of TBP in the treatment of alcoholic hepatitis from the point of blocking the activation of macrophages by hepatocytes in animal and cell models, so as to provide experimental basis for drug application and development.

肝脏巨噬细胞的过度活化在酒精性肝炎的发病中起着至关重要的作用。抑制巨噬细胞活化水平，可减轻炎症反应，对酒精性肝炎起到保护性作用。近年来的研究表明，酒精依赖于caspase-3/ROCK1信号通路诱导肝细胞分泌大量的细胞外囊泡，通过携带高浓度的CD40L直接激活巨噬细胞，这是酒精性肝炎中巨噬细胞持续活化的重要机制。我们前期研究表明，鹿仙草多糖可抑制肝脏巨噬细胞的活化水平，对酒精性肝炎小鼠具有良好的肝保护作用。预实验提示，这一作用与细胞外囊泡CD40L有关。我们推测：鹿仙草多糖通过caspase-3/ROCK1信号通路抑制肝细胞生成细胞外囊泡CD40L，从而降低巨噬细胞活化水平，改善酒精性肝炎的肝损伤。本项目拟在动物和细胞模型中，从阻断肝细胞对巨噬细胞活化作用的角度，进一步研究鹿仙草多糖在酒精性肝炎治疗中的药理作用机制，为药物的应用开发提供实验基础。

探讨治疗酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)的新靶点，不断开发治疗AH药物，具有重要的科学研究意义和临床应用前景。肝脏巨噬细胞（包括枯否氏细胞）过度活化所诱发的炎症反应被公认为在AH的发病中起着至关重要的作用。近年来的研究表明，来源于肝细胞的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)携带着大量的CD40L是激活巨噬细胞的重要因素。调节肝细胞来源的EV-CD40L生成，可抑制巨噬细胞活化水平，减轻炎性反应，对AH起到保护性的作用。鹿仙草是蛇菰科蛇菰属植物筒鞘蛇菰及其近似植株的全草，作为民族药长期使用，具有补肝益肾、清热解毒，消肿止痛等作用。但是鹿仙草对AH的作用及其机制还不明确。本实验提取鹿仙草多糖，制备AH小鼠动物模型，观察鹿仙草多糖对AH的作用。结果显示，鹿仙草多糖可显著减少酒精摄入引起的肝细胞空泡变性、肝组织的脂质沉积和炎性细胞浸润；降低血清ALT水平；降低小鼠肝脏甘油三酯和总胆固醇的含量，对AH具有显著的肝脏保护作用。鹿仙草多糖显著降低AH小鼠肝脏的炎症反应，尤其是巨噬细胞的过度活化,这可能是鹿仙草多糖对AH保护作用的机制之一。同时，鹿仙草多糖抑制了酒精诱导的小鼠肝脏miR-155的表达，改善自噬溶酶体蛋白表达，下调肝细胞EV-CD40L的分泌。这些结果说明，鹿仙草多糖通过抑制miR-155介导的“自噬-外泌体”轴，降低肝细胞EV-CD40L分泌以降低巨噬细胞活化程度，减轻酒精性肝炎的肝脏炎症反应。体外细胞模型实验也进一步证明，鹿仙草多糖的使用明显的抑制了酒精诱导的肝细胞miRNA-155的生成，恢复溶酶体蛋白LAMP1和LAMP2的表达，改善自噬通量，抑制酒精导致的肝细胞EV的生成。在酒精的直接刺激下，鹿仙草多糖作用后的肝细胞EV对巨噬细胞的活化作用显著降低，说明鹿仙草多糖通过作用于肝细胞EV-CD40L来抑制肝脏中巨噬细胞的过度活化。本项目以抑制巨噬细胞活化为主要靶点，进一步阐明中草药鹿仙草在AH治疗中的药理作用机制，为药物进一步的有效成分分离鉴定和应用开发提供实验基础，并可能为AH的治疗带来新的视角。