IRE1调节的细胞自噬在生长板软骨发育中的作用与机制

Autophagy participates in the development of growth plate cartilage with the secretion of type II collagen(Col2), which is the necessary developmental regulation process. Our previous study(81171697) showed that IRE1,with BMP2/PGRN, forms a negative feedback loop and acts in concert in the course of osteoblastogenesis as a core molecule of ER stress.The expression of autophagy associated gene ATG5/LC3β reduced remarkably in the IRE1 conditional knockout mice, and autophagy can not be activated.It is showed that IRE1 can regulate the.development of growth plate cartilage through cell autophagy,however,the mechanism also remains unknown. In this study,we integrated use the IRE1 conditional knockout (cKO) mice and wild type mice, combined with such methods as stem cell micromass culture, mouse chondrocyte primary culture, mouse metatarsal bones induced culture in vitro, immunohistochemistry(IHC), Q-PCR and immunoblotting, detected the regulation of IRE1 on three types autophagy, analyzed on how to regulate cartilage development through autophagy, clarified whether IRE1 regulated chondrocyte development depends on autophagy and the downstream JNK/NF-κB/P38/Erk1/2 signal pathway, revealed the effect and mechanism of IRE1-modulated autophagy in the development of growth plate cartilage.

自噬在生长板软骨细胞中通过调控colII分泌参与软骨分化，是骨生长必需的发育调节过程。我们前期研究表明(81171697)：IRE1作为ER stress核心通路分子，与BMP2/PGRN形成负反馈环调控骨形成；IRE1软骨特异性敲除(IRE1-/- cKO)小鼠生长板软骨细胞中，自噬标志基因ATG5/LC3β表达显著降低，自噬不能激活，提示IRE1可能通过自噬调控生长板软骨发育，具体机制不清楚。本研究综合运用IRE1-/-cKO小鼠和对照小鼠，结合三种不同类型干细胞微团培养、小鼠软骨细胞原代培养、体外趾骨组织团块培养、IHC、Q-PCR、免疫印迹等方法，检测IRE1对三种不同类型自噬的调控作用；分析IRE1如何通过自噬调控软骨发育；阐明IRE1调节软骨细胞分化是否依赖于自噬及下游JNK/NF-κB/P38/Erk1/2等信号通路；揭示IRE1调节的细胞自噬在生长板软骨发育中的作用与机制。

骨骼的生长与发育依赖于生物合成与分解代谢两大生物学过程的协同控制。细胞自噬，作为真核细胞内存在的一种蛋白质降解体系，负责运输细胞内错误蛋白质或衰老、损伤组织到溶酶体进行降解，通过调节合成、分解代谢参与细胞生存和组织稳态的维持，通过调控生长板软骨细胞中ColII的分泌参与软骨分化，是骨生长必需的发育调节过程。本研究综合运用Cre小鼠、ERN1条件性敲除小鼠（ERN1 CKO）及C57 WT等一系列不同品系的小鼠，联合重组腺病毒Ad-IRE1α、siIRE1α、Ad-ATG7、Ad-ATG5、siATG7、siATG5并结合三种不同类型干细胞(ATDC5,C3H10T1/2,BMSCs)微团培养、小鼠软骨细胞原代培养、体外趾骨组织团块培养、关节腔注射、免疫组化、qPCR、免疫印迹等实验方法，探究ERN1/IRE1α在小鼠软骨生长板中的作用与机制。通过本项目研究，我们在体外和体内实验中验证了ERN1/IRE1α对软骨组织形态、软骨细胞增殖和分化以及软骨内骨化的作用，证明软骨组织特异性敲除ERN1，促进小鼠体长体重增加，加快小鼠软骨生长板中软骨细胞肥大和软骨内骨化，同时上调IHH表达，下调PTH1R表达，破坏IHH、PTHrP/PTH1R反馈环路稳态；转录因子XBP1s结合并上调IHH和PTH1R的表达，p-IRE1α磷酸化抑制剂4μ8C抑制XBP1s生成，下调IHH和PTH1R的表达，同时促进软骨细胞增殖，抑制其凋亡。本研究系统阐明了ERN1/IRE1α缺陷引起的IHH、PTHrP/PTH1R反馈环路失衡是导致ERN1缺陷小鼠生长板软骨肥大加快、软骨发育异常的潜在机制，为深入揭示 ER stress 调控自噬与软骨发育的关系提供理论和实验依据，也为后续研究软骨发育不良、关节炎等骨相关疾病的预防和治疗寻找到重要的靶分子和突破口奠定基础。