ADAM9 通过调控细胞自噬影响肝癌放疗敏感性的机制研究

Tumor radiosensitivity could be affected by autophagy. ADAM9, a zinc-dependent transmembrane protein, widely presented on cell membrane, promotes the development of hepatocellular carcinoma(HCC). However, the relationship between ADAM9 and radiosensitivity of HCC has not been reported. In preliminary experiments, we investigated the histological examination of human HCC specimens resected after radiotherapy and found that ADAM9 was negatively correlated with the apoptosis of cells. The results of cell experiments showed that ADAM9 reduced the radiosensitivity of HCC cells and autophagy mediated this process. Based on the above results, we propose the hypothesis that ADAM9 could reduce the radiosensitivity of HCC by inducing autophagy. This project intends to study the function of ADAM9 on the radiosensitivity of liver cancer and the role of autophagy in the process by using human hepatoma cell lines, nude mouse models of liver cancer, resected human liver cancer tissue specimens after radiotherapy.Experimental technology such as CO-IP, mass spectrometry, signal transduction microarrays, transcription factors microarrays, RNA interference and lentivirus overexpression would be applied to explore the molecular mechanism of ADAM9 regulating autophagy in hepatoma cells.The effect of ADAM9 on radiosensitivity of hepatocellular carcinoma would be explored on cellular, animal and clinical levels. The mechanism of radiosensitivity of HCC would be further revealed and new ideas for improving radiotherapy efficacy of HCC would be provided.

自噬能够影响肿瘤放疗敏感性。ADAM9，一种广泛存在于细胞表面的锌依赖跨膜蛋白，促进肝癌发生发展，但其与肝癌放疗敏感性的关系尚无报道。在预实验中，我们研究放疗后手术切除的人肝癌组织标本发现ADAM9与细胞凋亡蛋白表达呈负相关；细胞实验表明，ADAM9降低肝癌细胞放射敏感性，自噬介导了该过程。基于以上结果，我们提出ADAM9通过诱导细胞自噬降低肝癌放疗敏感性的假说。本项目拟用人肝癌细胞系、裸鼠肝癌模型、放疗后手术切除的人肝癌组织标本,通过体内外实验深入研究ADAM9对肝癌放疗敏感性的影响及自噬在该过程中的作用；通过CO-IP、质谱分析、信号通路芯片、转录因子芯片及RNA干扰、慢病毒过表达等技术探讨ADAM9调控细胞自噬的分子机制。本项目将在细胞、动物、临床组织水平揭示ADAM9对肝癌放疗敏感性的影响，将以ADAM9这个新视点进一步阐明肝癌放疗敏感性的分子机制，为增强肝癌放疗疗效提供新思路。

放疗在肝癌治疗过程中的作用日益显著。在基础和临床研究中阐明调控肝癌放疗敏感性的相关机制、增加肝癌细胞放射敏感性、提高肝癌放疗疗效是目前亟需解决的关键问题。ADAM9能够通过诱导肝癌细胞EMT促进肝癌发展。结合前期预实验结果，我们提出ADAM9能够通过诱导肝癌细胞自噬降低放疗敏感性的假说。本项目通过western blot，qRT-PCR，免疫荧光，免疫组化在肝癌细胞和肝癌组织中探讨了X 线对肝癌细胞 ADAM9 蛋白表达的影响，发现经X线照射后肝癌细胞和肝癌组织中ADAM9表达升高；通过细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠皮下瘤实验研究了ADAM9对肝癌放疗敏感性的影响，发现增加ADAM9含量后降低了细胞放疗敏感性；在体外、体内实验中，通过western blot或qRT-PCR检测自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I，自噬相关基因ATG5、ATG12、Beclin1，以及选择性自噬接头蛋白SQSTM1（p62）的表达水平，发现ADAM9能够诱导细胞自噬的发生；过表达或敲除肝癌细胞株中ADAM9表达后给予雷帕霉素（诱导自噬）或3-MA（抑制自噬）孵育，之后检测细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成以及通过western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bid、Bcl-2）的表达变化，发现自噬介导了ADAM9降低肝癌细胞放射敏感性的过程；此外，我们还发现ADAM9通过降低Nrf2表达诱导了细胞自噬的发生。在肝癌病理标本中验证了ADAM9与细胞自噬相关蛋白p62、凋亡相关蛋白Bax的相关性，进一步验证了ADAM9与细胞凋亡、细胞自噬的关系；以上研究结果已经发表。基于TMT蛋白质组学和磷酸化TMT蛋白质组学技术研究了改变ADAM9表达经X线照射后细胞中蛋白表达变化及磷酸化蛋白的变化，发现了与ADAM9表达相关的差异表达基因MCM2；通过CO-IP实验及蛋白组学分析，探讨了与ADAM9结合的蛋白分子，目前正在总结过程中。通过以上实验结果我们发现ADAM9能够通过诱导肝癌细胞自噬降低细胞放射敏感性，ADAM9能够通过影响Nrf2表达调控细胞自噬。其他的分子机制正在研究过程中。本课题的顺利实施明确了提高肝癌放疗敏感性的新靶标，为提高肝癌放疗疗效奠定了实验基础和理论依据。