结核分枝杆菌毒素蛋白分泌系统ESX-1的调控网络解析

结核菌是人类肺结核的病原菌，结核菌的ESX-1分泌系统负责将ESAT-6在内的毒素蛋白传递到宿主细胞中，对结核菌的毒力至关重要。已知ESX-1系统的调控因子有EspR、PhoP和MprA，它们都是通过影响EspA的表达而调节ESX-1系统的功能。我们发现EspR、PhoP和MprA之间可能存在交叉调控，提示这三个调控因子和EspA一起构成了ESX-1系统的立体调控网络。本项目以此为基础，首先表达纯化调控基因产物，通过调控蛋白与调控基因启动子的相互作用，阐明调控蛋白对调控基因启动子的特异结合以及结合调控基因启动子和espA启动子时调控蛋白之间的协调关系；然后通过蛋白双杂交及磷酸基团转移分析阐明调控蛋白之间的相互作用及调控系统之间的交流；最后通过报告基因及调控基因的表达分析阐明调控因子之间的交叉调控。从而即可以了解每个调控因子在调控网络中的作用，又可以在整体水平上将各个调控因子联系起来。

结核菌是肺结核病的病原菌，以ESAT-6为代表的分泌蛋白是一类非常重要的致病因子。ESAT-6通过ESX-1系统分泌到体外。ESAT-6的编码基因在RD-1区，在RD-1上游的espA对ESX-1的功能是必不可少的。由于EspA也是ESX-1的底物蛋白，因此，EspA与ESAT-6等其它ESX-1系统底物蛋白的分泌相互依赖，为ESX-1的调控提供了另一种可能，即通过EspA实现对ESX-1系统的调控。目前，已知的ESX-1的调控因子包括PhoPR，EspR和MprAB。EspR和MprA可以直接结合在espA启动子上，激活espA，促进ESX-1系统的分泌，但PhoPR的调控途径未知。..EspR、MprA和 PhoP似乎都是通过直接或间接影响espA的表达实现对ESX-1系统的调控，那么这三个调控因子之间是否存在潜在的调控关系？本项目的主要目的在于揭示ESX-1的三个调控因子之间是否存在交叉调控关系，解析调控因子与EspA形成的立体调控网络。..综合本研究的结果，我们提出了ESX-1的调控网络模型，并：1，推测了PhoPR调控ESX-1系统的途径。在phoP突变菌中虽然espA操纵子的表达降低，但PhoP并不能结合espA的启动子序列，说明PhoP对ESX-1的调控必须由其它因子介导。我们的研究发现PhoP可以结合espR启动子的上游序列，产生一段约30-bp的保护区。由于EspR对espA的直接调控以及在phoP突变菌中espA的表达下调，我们推测EspR可能介导了PhoPR对ESX-1系统的调控；2，发现了MprAB调控ESX-1的两个新途径。此前的研究表明espA启动子的上游序列存在多个MprA结合位点，说明MprA可以通过通过直接影响espA调控ESX-1系统的功能。在本研究中我们发现MprA也能结合espR启动子的上游序列，产生两个保护区，提示除了直接由EspA介导的途径，MprA也可能通过EspR一步介导调控ESX-1。我们进一步发现MprA可以特异结合phoP启动子序列，因此MprA也可能通过由PhoP到EspR的二步介导调控ESX-1系统；3，揭示了MprA与PhoP的竞争关系。由于MprA和PhoP都可以直接结合espR的上游序列，而且两者的保护区重叠，在与espR启动子相互作用时，MprA与PhoP存在竞争关系。