香蕉枯萎病抗病突变体的分子鉴定

在前期研究中，通过化学诱变'威廉斯'，获得了香蕉枯萎病抗病突变体，构建了4个消减抑制杂交（SSH）文库，获得了475个Unigenes，克隆了10个抗病相关基因cDNA全长。在此基础上，拟通过microarray检验文库克隆子的阴阳性和相对表达量；通过RACE继续克隆3～5个抗病相关基因；通过Northern印迹和Real-time PCR，检测基因对接种病原菌的响应效果，并利用相应的物理化学和电镜检测方法，检测相关的抗病物质和信号分子的数量变化及分布特征, 初步筛选出关键抗病基因；利用Southern印迹分析其拷贝数；通过转化拟南芥和野生蕉，鉴定其抗病功能；施用水杨酸、茉莉酸甲酯等不同激发子处理后，分析各基因的表达模式，推测各自可能遵从的抗病调控途径；最后，在拟南芥中找出相应途径的多个标志性基因，检测转基因后它们表达的变化，从而探讨各个关键抗病基因在途径中的位置及调控作用。

香蕉枯萎病对香蕉产业危害巨大。本项目前半阶段，在以栽培香蕉感病亲本和其抗病突变体为材料构建的消减抑制杂交文库（SSH）基础上，进行了microarray分析、抗病相关基因表达模式分析、克隆与遗传转化等研究。向GenBank递交了257条EST序列（JZ482668-JZ482922）和4个防御基因的全长序列（JF271126-JF271128，HQ823613）。Microarray分析进一步确定74个基因在抗病突变体中或在接种后发生了差异表达；Real-time PCR检测了19个关键抗病相关基因从侵染开始到植株死亡整个过程中的表达情况，发现有4个基因在整个过程中保持上调表达，可能是栽培香蕉抗枯萎病的关键调控基因。利用香蕉枯萎病病原菌接种拟南芥、烟草和番茄等模式植物的多份基因型材料，发现只有番茄的Money maker感病；进而为其建立了遗传转化体系并将克隆得到的10个抗病相关基因进行了遗传转化（8个基因获得了转基因植株）。然而，基因转化试验表明，广谱抗性基因没能明显提高植株对枯萎病菌的抗性。多份香蕉材料的再生试验结果表明，唯有祖先种Musa balbisiana具有相对较高的再生效率，但整体再生效果仍然很低。基于广谱抗性基因没有明显提高转基因番茄的抗病性，且栽培香蕉品种的抗性水平有限，而野生种抗性水平很高等原因，项目后半阶段，转向以野生蕉为材料进行研究。对30多份野生种质资源进行了抗病性评价，筛选出了高度抗病的和高度感病的香蕉野生祖先珍稀种质；通过生物信息学分析鉴定了香蕉基因组所有NBS类抗病基因（R基因）。目前，正在以珍稀野生香蕉近缘种为材料，开展NBS类R基因克隆和功能鉴定、抗病野生蕉与感病栽培种抗性差异的分子分析等研究工作。总体上，本研在一定程度上分析了抗病突变体与感病亲本抗性差异的分子基础；找到并建立了理想的用于抗病性鉴定异源转化受体；筛选和鉴定了高抗的珍稀野生种质资源，从而为深入开展香蕉抗枯萎病分子机理研究开拓出广阔的基础，凝练出理想的研究方向。