棉花显性无腺体基因Gl2e的图位克隆及功能分析

Cotton is not only important fiber plants, oil plants, but also second plant protein sources except soybean. If cottonseed protein can be used as a food source, the world's annual production of cottonseed could meet the protein needs of 500 million people a year. However, due to the gland in the seeds of general cultivation of cotton varieties which contains gossypol and its derivatives toxic to human and mono-gastric animals, the existence of the glands become the biggest obstacle to cottonseed utilization. Therefore, it is necessary to research on the molecular mechanisms of the gland formation..In this study, we aimed at the key gene that control cotton gland traits: dominant gland gene Gl2e, "zhongmiansuo12" and its dominant glandless near-isogenic lines were used as the experimental materials, based on existing fine mapping results, continue fine mapping and isolation of Gl2e gene, validate expression in gland and glandless material for the candidate genes, respectively, isolate and clone the candidate genes , then construct RNAi vectors and over-expression vector, identify the function of Gl2e gene by transgenic technology. This study aims to reveal the molecular mechanisms of gland formation, to provide a theoretical basis for cotton low-gossypol breeding.

棉花是集纤维、油料和植物蛋白于一身的作物，尤其是其棉籽蛋白含量，是仅次于大豆的重要植物蛋白源。如能利用棉籽蛋白作为食物来源，全球每年生产的棉籽可满足5亿人一年的蛋白需求。然而，由于栽培棉品种的种子和植株具有色素腺体，其中含有对人和单胃动物有毒的棉酚及其衍生物，腺体的存在已成为棉籽开发利用的最大障碍。因此，有必要对棉花腺体形成的分子机制进行科学研究。.本研究针对控制棉花腺体性状的关键基因显性无腺体基因Gl2e，利用"中棉所12号"及其显性无腺体近等基因系"中棉所12号显无"为实验材料，借助项目组完成的A、D基因组测序数据，对Gl2e基因进行精细定位和分离克隆，通过转基因技术对Gl2e基因进行功能验证。研究旨在揭示腺体形成的分子机制，为棉花低酚育种提供理论依据。

棉花是优良的天然纤维资源，也是重要的营养资源。棉属特有的色素腺体和棉酚对棉花抵抗病虫害起重要作用，但也限制了棉籽的利用，所以培育低酚棉是棉花育种的一个重要方向。显性无腺体基因Gl2e可以控制色素腺体的形成，在低酚棉育种中具有十分广阔的应用前景，所以对其研究具有重要意义。.本实验以中棉所12号和中棉所12显性无腺体、辽棉7号和辽棉7显性无腺体两对近等基因系为亲本构建了两个F2群体，对棉花无腺体基因Gl2e进行精细定位。群体符合1:2:1的遗传分离比，证明棉花的显性无腺体性状是由一对不完全显性基因所控制。利用已知与显性无腺体基因紧密连锁的SSR标记NAU2251以及亚洲棉基因组数据，找到了NAU2251所在的800kb大片段，利用新开发的SSR标记和InDel标记，将目的基因锁定15kb内。两个群体结果一致，相互验证了准确性。.注释分析发现该区间仅含有1个基因，编码475个氨基酸。结构预测发现此蛋白属于bHLH-MYC转录因子家族成员。荧光定量检测表明该基因在有腺体材料和无腺体材料中有较大的表达差异，为本研究的目标候选基因。该基因在有腺体和无腺体之间有三个碱基差异，其中一个导致了bHLH-MYC_N区域中的氨基酸突变。BLASTp结果显示该基因是一个未知功能的新基因。对候选基因上游启动子序列顺式作用元件分析，发现其可能参与植物生长发育过程中的多种生物调控途径。.通过农杆菌转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位实验，MYC蛋白定位在细胞核内，符合转录因子的特点。通过LiAc方法将候选基因转化酵母发现，中12显性无腺体中的单个氨基酸变化导致该转录因子的转录活性大大降低。.为了进一步研究该基因功能，我们将有腺体和无腺体中的基因分别与pBI121载体连接，置于35S强启动子下构建过表达载体、反义表达载体和RNAi表达载体，转化农杆菌，遗传转化棉花，进行转基因功能验证，RNAi转基因植株表现为全株无腺体。另外采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）方法对候选基因进行功能研究，沉默后有腺体棉株表现为无腺体表型， qRT-PCR结果表明沉默植株中的候选基因表达量大大降低，证实该基因在棉花色素腺体发生过程中起关键作用。同时，显性无腺体基因Gl2的可能成功，也为研究棉花其他无限体基因直至为分离植株有腺体种子无限体基因奠定了基础。