利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌活性成分多样性的研究

Fungal genomes are noted to exist in a heterochromatin state whose constitutive genes are often transcriptionally controlled by epigenetic regulation. Manipulation of the fungal epigenome is proved to be an effective method for accessing natural products from silent biosynthetic pathways. DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibitors are the only reported small molecule regulators for fungi epigenetic modifying treatment. Other types of epigenetic modifiers, such as Sirtuin modulators, histone acetyltransferase inhibitors, Histone lysine methyltransferase inhibitors, histone demethylase inactivators are not found for this kind of research..In this study, we will focus to investigate the stimulation methods for the activation of marine secondary metabolites silent biosynthetic gene clusters by chemical epigenetic approach. First, we will utilize traditional activators SAHA to find sensitive marine fungi strains. Those stains will be further investigated using new types of epigenetic modifiers. Finally, the new developed secondary metabolites by this study will be isolated and multiple screening methods will be used for activity to find leading compounds for drug discovery. The chemical epigenetic approach is suitable for marine fungi secondary metabolites study which genetics background is unclear. This study has great practical value and theoretical significance.

近年来的研究表明，真菌的次生代谢生物合成与其基因簇所处的表观遗传状态有着密切的关系。通过表观遗传操作能够大范围改变微生物次级代谢产物谱，激活沉默次级代谢产物的生物合成。目前文献报导的化学表观遗传试剂只有组蛋白脱乙酰化酶抑制剂及DNA甲基转移酶抑制剂，对于其他类型的小分子化学表观遗传试剂（去乙酰化酶调节剂；组蛋白乙酰基转移酶抑制剂；组蛋白脱甲基酶抑制剂）在真菌次生代谢产物的研究中还未见任何报导。本项研究拟深入探讨化学表观遗传试剂对海洋真菌沉默基因的激活方法，首先利用SAHA刺激获得代谢谱发生明显变化的菌株。进一步尝试其他类型化学表观遗传试剂，激活沉默基因，希望发现新型的对真菌次生代谢有效的调控物质。最后利用化学排重及多种活性模型对调控产生的新化合物及活性化合物进行分离，为海洋真菌创新药物研究提供先导化合物。该方法适用于遗传背景模糊的海洋真菌次生代谢产物研究，具有很强的实际应用价值和理论价值。

本项研究对来源于中国南海的深海真菌、深圳湾红树林的土壤真菌及红树内生真菌共72株进行了化学表观遗传刺激筛选，在发酵液中同时添加DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷（5-azacytidine，5-Ac）以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酸双异羟肟酸（suberic bishydroxamate，SBHA），经TLC和HPLC对比加刺激物组及未加刺激物组发现28株菌株的次生代谢产物谱发生变化，占总实验菌株数的38.8%； 其中7株变化明显，比例为9.7%。进一步对刺激后有新的次生代谢产物信号产生的菌株W2（Aspergillus sp.）、W3（Aspergillus sp.）、W6（Fusarium sp.）、W20（Aspergillus sp.）及W21（Trichoderma sp.）进行了深入的化学成分研究。从上述菌株正常发酵及加入化学表观刺激剂后的发酵提取物中共分离并鉴定了90余个化合物，包括新化合物21个，其中10余个化合物如新型的艾里莫芬烷型倍半萜类化合物及糖基化的二苯醚类化合物只有在添加化学表观遗传刺激物才生产。活性测试后发现具有抗菌、抗一氧化氮产生、抗Aβ42多肽聚集以及细胞毒性等活性的化合物50余个。其中一个苯二氮卓类化合物对LPS诱导神经胶质细胞BV2释放NO有较强的抑制作用，综合n=8的实验数据显示能显著性改善阿兹海默症转基因果蝇模型的学习缺陷，具有潜在的应用于神经推行性疾病的价值。此外，我们首次尝试使用姜黄素（选择性组蛋白乙酰基转移酶抑制剂）以及白藜芦醇（去乙酰化酶激活剂）等其他类型的小分子化学表观遗传刺激物来激活真菌“沉默”的次生代谢产物基因。有意思的是Aspergillus sp. SCSIOW2菌株能够转化白藜芦醇生成一个带有特殊二氢苯并呋喃环结构的衍生物Arahypin-16，该化合物具有较强的DPPH自由基消除活性和AAPH诱导的细胞膜保护活性。Fusarium sp. SCSIOW6菌株可以还原姜黄素生成结构更稳定的转化产物，利用ThT模型对这些衍生物进行抗Aβ42聚集活性检测，发现姜黄素衍生物表现出较高的抗Aβ42聚集的活性。. 培养了博士后1名，研究生7名，已经顺利毕业5名，申请化合物专利4项，包括一项PCT国际专利，发表SCI收载论文3篇，中文核心期刊1篇，尚有两篇论文正在准备中。