真菌防御素Plectasin的构效关系及基于革兰氏阳性球菌靶被膜分子的抗菌机制

在前期工作基础上，针对Plectasin分子特征，采用截取α-螺旋和β-折叠完整结构、氨基酸整体突变（Loop结构、特征残基）及丙氨酸扫描法研究Plectasin功能二级结构及功能残基，为其分子改造和设计提供理论依据；针对Plectasin专抗革兰氏阳性菌、不同价阳离子及不同型异构体对其活性影响大等有别于其它防御素抗菌机制的特征，采用革兰氏阳性菌细胞被膜主要元件（脂磷壁酸、肽聚糖及膜蛋白）分离技术结合肽与细胞被膜主要元件相互作用技术从分子水平研究Plectasin作用细胞被膜靶点，采用电镜和膜片钳技术分别从形态学和离子通道水平研究Plectasin对细胞被膜超微结构和跨膜离子流影响，阐明其作用革兰氏阳性球菌细胞被膜新机制，为完善防御素抗菌机制提供理论依据。研究将推动Plectasin在兽药和传统饲料抗生素替代品等领域尤其在防治猪链球菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌病中的应用。

按照合同任务书要求，完成全部任务。主要研究成果如下：.（1）Plectasin构效关系研究. 研究了二硫键对Plectasin抑菌活性的影响。将含有二硫键突变体的重组表达载体转入毕赤酵母进行诱导表达。表达产物经G-25纯化后，对其抑菌活性鉴定发现，C15-C37对抗菌活性影响较大，突变体（C15/37A）和（C4/15/30/37A）Plectasin抑菌活性几乎全部丧失；C19-C39对抗菌活性影响较小。表明二硫键对Plectasin抑菌活性的保持有重要作用。.　　研究了二级结构及关键氨基酸对Plectasin抑菌活性的影响。通过生物信息学工具结合构效关系对Plectasin进行结构参数优化，对其第9、13和14位氨基酸进行突变，将其基因序列克隆至pPICZαA载体并电转化毕赤酵母获得衍生肽NZ2114和MP1102。MP1102对金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC43300抗菌活性分别是NZ2114的2倍和15倍。它们均不具有溶血性；对温度和pH具有一定耐受性。.（2）Plectasin 衍生肽NZ2114杀菌机理研究.　　凝胶阻滞实验证明NZ2114不能与金葡基因组DNA结合；生长动力学结果表明其对金葡细胞壁合成有干扰作用；细胞膜疏水性实验表明其对细胞膜疏水性有一定影响；K+泄漏分析NZ2114不引起细胞K+泄漏；流式细胞仪分析和透射电镜观察表明NZ2114对细胞膜没有造成明显的破坏。.（3）金葡信息素引导的靶向抗菌肽分子设计、功能分析与机理研究.　　将S. aureus信息素序列AgrD添加至Plectasin N端。构建重组rAgP表达载体pPICAgPlectasin和pGAPAgPlectasin，转化毕赤酵母。诱导型表达产物和组成型表达产物经阳离子交换层析和疏水层析得到rAgP纯品，产量为150mg/L，纯度达到94 %。.　　与母体肽不同，rAgP对金葡ATCC标准菌株MIC在0.09 -1.47 μM之间，对其它类型供试菌株MIC值大于23.66 μM。rAgP对20株临床分离MRSA的MIC值在0.37 -2.96 μM之间。rAgP10h杀菌效率超过99 %；，并未出现病原菌再次生长的翘尾现象。游离信息素AgrD干扰实验表明，rAgP杀菌能力受AgrD影响，并呈剂量效应。