基于αvβ3整合素途径的[rFN/CDH-紫杉醇]纳米自组装体降低骨肉瘤术后复燃及其机制研究

The main limitation after osetosarcoma resection is the recurrence caused by hidden satellite lesion. Previous study showed that angiogenesis was highly correlated to carcinogenesis, while over-expressed αvβ3 integrin in tumor vasculature contributed to the homing of cancer cells into their niches. Our previous NSFC grant reveals that rFN/CDH, as a specific activator of αvβ3 integrin, can be self-assembled into calcium phosphate ceramic and contribute to improved osteoconducive and osteoinductve properties. Hereby we postulate that when conjugated with chitosan (HGC) into nanoparticle, paclitaxel (PTX) can be incorporate in to calcium phosphate self-assembled system and exert anti-cancer performance. A PTX-HGC nanoparticle can be faricated for preparing [rFN/CDH-PTX] self-assembled nano-construct. Supplementary ex vivo and in vivo functional assays will be established to evaluate its anti-cancer functionality. Besides, the co-culture of osteosarcoma tumor cells and vessel-related cells will be employed to investigate the expression of angiopoietin, the activation of receptor tyrosine kinase Tie2, and ECM synthesis/degradation balance, which will togetherly reveal the molecular cascade and its possible mechanism orchesterd by αvβ3 integrin during ECM remodeling.As an expansion to our previous NSFC programme, this project could offer new insight into the relationship between integrin remodeling on tumor cell surface and their mobility.

骨肉瘤术后潜伏病灶复燃是影响远期治疗效果的核心问题。血管新生是骨肉瘤侵袭的重要机制，异常表达于脉管系统中的整合素可与胞外基质作用调控瘤细胞归巢。前一NSFC项目发现重组纤连蛋白/钙粘蛋白（rFN/CDH）可选择性激活αvβ3整合素，将其自组装于钙磷陶瓷的生物界面兼有骨传导和骨诱导特征。藉此假设：将紫杉醇通过纳米颗粒技术“嫁接”于前述自组装系统，可赋予成骨修复界面抗肿瘤特征。以此修复瘤缺损可通过rFN/CDH-αvβ3途径实现紫杉醇对瘤细胞的靶向募集和杀伤。拟制备紫杉醇-壳聚糖纳米颗粒进而构建[rFN/CDH-紫杉醇]自组装体，体内外观察对靶向募集肿瘤的杀伤效应。另共培养骨肉瘤细胞、血管相关细胞，从血管生成素旁分泌、受体酪氨酸激酶Tie2活化和ECM稳态等层次，了解以αvβ3整合素为核心的ECM重构分子事件及相关机制，以揭示血管相关细胞导致肿瘤细胞整合素差异表达，进而导致迁移能力改变的机理。

骨肉瘤的治疗现状不容乐观，临床工作常面临“扩大切除”与“结构缺陷”、“保肢治疗”与“肿瘤复发”的矛盾。如何实现平衡需要解决关键的科学问题。本研究联合陆军军医大学第二附属医院骨肿瘤团队和中国药科大学药学院团队启动了课题攻关。第一部分实验中，以功能化壳聚糖、紫杉醇和重组蛋白rFN/CDH为基本原料，成功制备了紫杉醇-壳聚糖可溶性纳米颗粒（HGC3-PTX），并纳入LbL系统，在多孔双相钙磷陶瓷（pBCP）生物材料表面，构建了兼备高效促粘、抗肿瘤和骨修复双重功能的形成[rFN/CDH-( HGC3-PTX)]20 的纳米自组装体。完成了紫杉醇-壳聚糖可溶性纳米颗粒（HGC3-PTX）和[rFN/CDH-( HGC3-PTX)]20 纳米自组装体的生物理化特征的分析，其中包括载药特征（NMR、载药量、包封率、投料比、取代度）、纳米颗粒特性（粒径、稳定性、细胞毒性）、LBL界面特征（Zeta电位、红外光谱、X光电能谱、扫描电镜、接触角、PTX和rFN/CDH吸附量、释放量、细胞增殖率、细胞粘附力。第二部分实验中，在体验证了[rFN/CDH-( HGC3-PTX)]20纳米自组装体的体内外抗肿瘤作用及成骨修复能力：（1）建立裸鼠腹部皮下异位骨肉瘤成瘤模型，通过肿瘤体积/重量、增强核磁共振、活体荧光、组织染色的方法验证了局部增强的抗肿瘤效应。（2）建立了兔股骨髁部缺损模型，原位移植BCP-[rFN/CDH-(HGC3-PTX)]20纳米级自组装修复材料，HE染色和甲苯胺蓝染色发现宿主骨-材料交接区域成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞均活力正常，自组装体内的PTX并未影响骨修复能力。通过整合素信号途径内相关分子的基因蛋白表达检测，和腺病毒载体抑制表达的手段，初步阐明了[rFN/CDH-( HGC3-PTX)]20纳米自组装体对骨肉瘤细胞的趋化、迁移是经过经典的整合素α5β1-FAK Y397磷酸化途径完成，而细胞在BCP-[rFN/CDH-( HGC3-PTX)]20界面的粘附与伸展则是通过整合素αvβ3-FAK pS732-Tie 2信号途径，其中后者是本研究中意义较大的原创性发现。项目目前已完成所有研究任务，产出成果包括原创性论著6篇（4篇已发表，1篇新近接受，1篇审稿中），培养博士研究生1名、硕士研究生2名。国内学术大会专题发言2次，申请国家发明专利1项（尚未公示）。