携MT质粒声致相变纳米粒促进大鼠肝细胞再生的实验研究

Liver may suffer acute hepatic failure if the graft or remnant liver was too small after liver transplantation or partial hepatectomy (PH). It is crucial to induce liver regeneration in case of hepatic failure. Metallothionein (MT) is an efficient factor to induce liver regeneration. If we can transfect MT plasmid (pMT) into hepatocyte , it may brings new hope for liver regeneration. Cationic microbubble , a frequently-used gene vector, is limited in the application of liver transfection, for its larger size compared with the gap of vascular endothelial cell. Cationic nanoparticle (NP+) wrapped with perfluorocarbon, a research focus in molecular imaging, has the potential to extravasate into hepatocyte. The phase changed NP+ becomes microbubbles which can be used for ultrasound-targeted microbubble destruction to mediate gene transfection. Therefore, we are trying to prepare a pMT-loaded acoustic droplets vaporized NP+ by combination of positively charged lipids and perfluoropentane. Furthermore, investigate the efficiency of NP+ and ultrasound combination on inducing gene transfection of hepatocyte, and the role of MT in liver regeneration, which have the potential to be further used in efficient gene therapy of liver regeneration, and provide experimental foundation.

肝移植或部分肝切除术后肝体积相对过小会引起急性肝功能障碍，术后促进肝细胞的再生使肝脏长到足以维持机体代谢需求是有效防止肝衰竭的关键。金属硫蛋白（MT）是一种有效的促进肝细胞再生的因子，若能将外源性MT基因导入肝细胞，有可能为肝细胞再生带来新的希望。阳离子微泡作为一种常用的基因载体，因粒径大、难以穿过血管内皮间隙限制了其在体内肝细胞基因转染上的应用。作为近年来分子影像学研究热点之一的包裹液态氟碳相变型阳离子纳米粒（NP+）使得基因穿过血管内皮间隙到达肝细胞成为可能，当纳米粒相变为微泡后又能联合UTMD技术促进基因转染。故本研究拟采用带正电荷的纳米粒与PFP制备一种可携带MT质粒的声致相变NP+，在建立大鼠90%极限肝切除的基础上，探索NP+联合超声辐照在增强肝细胞基因转染上的作用；及MT是否具有促进大鼠肝细胞再生的作用，并为未来可能的新型高效促进肝细胞再生的基因治疗探索实验方法和提供实验基础

肝移植或部分肝切除术后肝体积相对过小会引起急性肝功能障碍，术后促进肝细胞的再生使肝脏长到足以维持机体代谢需求是有效防止肝衰竭的关键。金属硫蛋白（MT）是一种有效的促进肝细胞再生的因子，若能将外源性MT基因导入肝细胞，有可能为肝细胞再生带来新的希望。阳离子微泡作为一种常用的基因载体，因粒径大、难以穿过血管内皮间隙限制了其在体内肝细胞基因转染上的应用。作为近年来分子影像学研究热点之一的具有刺激响应相变性能的包裹液态氟碳相变型阳离子纳米粒（NP+）使得基因穿过血管内皮间隙到达肝细胞成为可能，当纳米粒相变为微泡后又能联合超声靶向破坏微泡（UTMD）技术促进基因转染。本研究拟制备一种可携带MT质粒（pMT）的包裹全氟戊烷（PFP）阳离子纳米粒(pMT-NP)，在建立小鼠大部分肝切除（PH）的基础上，探索pMT-NP联合超声辐照增强肝细胞基因转染及促进肝细胞再生的作用。我们在前期工作研究的基础上制备了较稳定的包裹液态氟碳相变型pMT-NP，对其理化特性进行测定；并进一步探究该纳米粒在体外及体内的相变条件及显影情况；然后对纳米粒在小鼠体内基因转染最适条件进行探究；最后评估在最适超声转染条件下，小鼠大部分肝切除后，pMT-NP联合超声辐照（US）促进肝细胞再生的作用。实验结果：成功制备稳定的包裹液态氟碳NP+。固定占空比为50%，当超声辐照条件为3.0 W/cm2，辐照时间为2 min时，B-mode和CEUS 模式下见纳米粒乳液显影，取纳米乳液于显微镜下观察可见微泡形成；大鼠肝脏体内设置超声辐照能量为4 W/cm2，辐照时间为2 min时，可见肝脏显影。小鼠大部分肝切除术后48h，pMT-NP+US组肝组织MT表达显著高于单纯PH组，pMT-NP组及US组（P<0.05 for all）；术后第1、2、3及第7天，各组每单位体质量肝重比逐渐增加，pMT-NP+US组肝重比增加较对照组提前，且术后第7天，pMT-NP+US组较对照组肝重比增加明显（P<0.05 for all）。术后第2天及第7天，每高倍视野PCNA表达pMT-NP+US组明显高于对照组（P均<0.05）。本实验得到了相变型纳米粒通过超声转染质粒到小鼠肝细胞的最佳参数，并证明携pMT声致相变纳米粒能有效促进肝细胞再生，为未来可能的新型高效促进肝细胞再生的基因治疗探索了实验方法并提供了实验基础。