葡萄根缘细胞对自毒胁迫的响应机制及与其代谢相关功能微生物的RNA-SIP挖掘

Autotoxicity is the important reason of grape replant disease. In order to explore the changing mechanism of root exudate composition and its effect on rhizosiphere soil microorganism under the impact of autotoxicity. Based on previous research, 13CO2 pulse-labeling technique was used in this project and the ρ-hydroxybenzoic acid of grape autotoxin (the concentration from promotion to inhibition) was sprayed to Beta ( V. riparia×V.labrusca) grape seedlings.The number, survival rate and thickness of slime layer were checked, and the sugar, amino acid and phenolic acid contents in slime layer of root border cells were detected by LC-MS technique. In order to expound the regulating mechanism of autotoxin on border cells and extracellular slime layer, which was the main source of root exudate, the cell membrane permeability, ROS content, Ca2+ level and the expression level of key enzyme gene which regulated the metabolic pathways of sugar, amino acid and phenolic acid were measured. In order to clarify the regulating mechanism of border cells on microorganism, the microorganism ralated to border cells was identified by RNA-SIP and Illumina Miseq technique based on 13CO2 pulse-labeling experiment. The aim of our project was to reveal the mechanism of grape autotoxin from the point of border cells and microorganism.

自毒作用是葡萄连作障碍产生的重要原因。为探明自毒物质介导下，葡萄根系分泌物成分的变化机制及其对土壤微生物的作用效应。本项目在前期研究的基础上，采用13CO2脉冲标记技术，将葡萄自毒物质对羟基苯甲酸（浓度覆盖促进—抑制作用）加入到悬空法培养的贝达葡萄幼苗中，检测根缘细胞数量、存活率及黏液层厚度；同时采用LC-MS技术测定根缘细胞黏液层中糖、氨基酸及酚酸含量，从根缘及根尖细胞质膜透性、ROS含量、Ca2+水平以及控制糖、氨基酸及酚酸代谢途径关键酶基因的表达水平上，明确自毒物质对根缘细胞及胞外黏液层成分（根系分泌物的主要来源）的调控机制。同时结合13CO2标记试验，利用稳定同位素核酸探针（RNA-SIP）及Illumina Miseq测序技术，原位鉴定与根缘细胞代谢有关的功能微生物，明确根缘细胞对微生物的调控机制，从根缘细胞和土壤微生物对自毒物质的响应机制角度，揭示自毒物质的作用机理。

自毒作用是葡萄连作障碍产生的重要原因。为探明自毒物质介导下，葡萄根系分泌物成分的变化机制及其对土壤微生物的作用效应。本项目在前期研究的基础上,以葡萄根系分泌物的重要来源根缘细胞为研究对象，首次鉴定了贝达葡萄 (V.riparia×V.labrusca cv.Beta)的根缘细胞，发现自毒物质对羟基苯甲酸（4-HBA）能够改变根缘细胞的数量、活性、粘液层厚度及PME活性，同时还能改变根缘细胞的代谢通路，使根缘细胞黏液层分泌的物质由初级代谢转向次级代谢。逆境条件下，RBCs会调控水杨酸的分泌及相关酶基因的表达水平，刺激和诱导细胞内SOD、POD、CAT、GR和APX等抗氧化酶的活性，使其在4-HBA胁迫下保持相对较高的活性水平，从而清除积累的活性氧，使细胞MDA含量降低，缓解了4-HBA胁迫对葡萄幼苗的伤害。明确了RBCs从根尖脱落后，基因表达水平与根尖组织有明显的差异，受到不同浓度4-HBA处理的诱导或抑制。证实了葡萄根缘细胞exDNA的存在，明确了其具有抗菌作用。明确了信号转导过程参与了4-HBA对葡萄根系分泌特性的调控，4-HBA处理使贝达葡萄根尖细胞内Ca2+分布发生了显著的变化，逐渐向细胞质扩散，钙离子抑制剂或活性氧抑制剂与4-HBA共同处理抑制了葡萄根系酚酸的分泌及其相关酶活性的升高，说明4-HBA诱导的胞外钙离子和活性氧参与了此信号转导过程。鉴定了4-HBA处理后根缘细胞黏液层中的差异成分，初步测定了部分上调物质对微生物的作用效应；采用SIP技术，鉴定了12种与自毒物质4-HBA代谢有关的细菌，其中8种是首次发现。明确了4-HBA促进具有固氮、氨化或反硝化功能菌属的生长，抑制具有硝化功能菌属的生长。项目在施行期间发表论文5篇，其中SCI论文4篇;培养硕士研究生4名。