HPV16 阳性宫颈癌中SALL3等基因甲基化改变通过Hedgehog通路调控肿瘤局部免疫微环境

High-risk human papillomaviruse (HR-HPV)infection initiates cervical carcinogensis, which provides a perfect model to studythe relationship between infection and cancer. HPV16 caused more than half cases of cercvical carcinoma in Shaan'xi province. In our previous study, it was elucidated that local immunosuppressive status could promote cervical cancer,DNA methylation was significantly changed in cervical cancer compare to normal cervical tissue,such as Sall3, PD-L1 and FGF genes as well as DNA methylation transferase 3A.In present study, using molecular biological techniques and cytological methods,the dynamic expression pattern of the hedgehog pathway was detected in vivo and in vitro, the methylation change of SalL3, FGF,PD-L1 and Smo genes was assayed among cervical intra-epithelial neoplasia (CIN) and invasive cervical cancer . Furthermore, the relation to regulation role of DNMT3A and Hedgehog pathway was detected to reveal how the epigenetic regulation get the immunosuppressive effect on tumor microenvironment. We hope that our study could contribute the new idea to the cervical carcinogenesis and thereputic target.

女性生殖道HPV感染致宫颈癌发生的动态过程是研究"感染与癌症"的完美模型，HPV16感染引发陕西地区半数以上宫颈癌病例。我们前期研究发现宫颈局部免疫耐受现象是HPV感染后癌症的促发因素，宫颈癌中SALL3，PD-L1，FGF等基因甲基化改变明显异常，DNA甲基化转移酶3A上调。本研究利用分子生物学技术和细胞学试验方法，了解在体和离体情况下，宫颈癌发生过程中肿瘤微环境中Hedgehog通路在免疫细胞、肿瘤细胞中的表达模式，以及SalL3、FGF、PD-L1、Hedgehog通路中Smo基因的甲基化改变情况， 探讨DNMT3A 是否通过SalL3、FGF、PD-L1、Smo介导调控Hedgehog通路对肿瘤微环境中免疫抑制效应， 揭示表观遗传学在肿瘤微环境中对免疫耐受的调控机制，为宫颈癌发生机制提供新的理论依据和治疗思路。

通过对在体组织和宫颈癌细胞系中的研究发现：.1:Sall4和SOX11基因启动子区高甲基化，与正常宫颈组织相比，癌灶和癌旁组织中的SALL3及SOX11蛋白表达降低，与甲基化转移酶DNMT3A表达改变一致，但与H3K4me3负相关，说明H3K4me3-DNMT3A的调控表达轴参与了抑癌基因SALL3和SOX11启动子区高甲基化并抑制蛋白表达，使得两基因的肿瘤抑制功能减退，参与癌症进程，HPV癌蛋白并未直接参与这一调控机制。.2:宫颈癌时 mTORC1通路和Hedgehog通路异常活化， mTORC1通路中的S6K1被激活磷酸化后，Hedgehog通路中的GLI和PCTH表达增加，CoIP验证两通路间通过S6K1与GLI1在SiHa细胞核中结合进行直接对话。过表达HPV16E6和E7可以促进S6K1和GLI1蛋白的表达以及细胞核内结合，并有协同增强作用，但HPV16E6、E7未直接参与S6K1和GLI1蛋白的结合。 .3: Hedgehog通路中SHH基因启动子高甲基化，SHH去甲基化后可激活HH通路和细胞自噬活性。 HPV18 E6/7癌蛋白通过维持SHH的甲基化水平并阻断其相应的细胞自噬的调控，下调HPV18 E6、HPV18E 7引起SHH一定程度逆转，并且伴随宫颈癌细胞自噬活性增强。HPV18 E6能够抑自噬流的生成， E7对自噬流有直接阻碍作用。.4: 与正常宫颈组织相比，癌灶和癌旁组织中正性免疫因子mRNA表达量下降,负性免疫因子表达量增加，这些免疫因子基因启动子区甲基化异常，去甲基化药物可以逆转高甲基化状态，促进基因转录和蛋白表达。ChIP结果揭示HPV18 通过EZH2-H3K27me3-DNMT3A调节宫颈癌中免疫因子的表达， EZH2及H3K27me3通过改变DNMT3A的表达从而改变免疫因子和共刺激分子的表达。