线粒体质量控制及胞外囊泡介导的线粒体转移在矽肺成纤维细胞转分化中的作用

The transdifferentiation of lung fibroblast into myofibroblast is the pivot in the occurrence and development of silicosis. Mitochondrial quality control and extracellular vesicles mediated mitochondrial transfer likely participate in pulmonary fibrosis, yet the detailed mechanism needs to be proved. In this project, we will establish ex vivo silica-stimulated macrophage-induced lung fibroblast transdifferentiation model and an experimental silicosis rat model, combine with population epidemiological survey. SILAC-based LC-MS/MS will be applied to quantitatively study the mitochondrial proteomics in fibroblast and extracellular vesicles. Using the techniques of protein import and degradation, Blue Native PAGE，fluorescence labelling, protein overexpression and RNA interference, the roles of extracellular vesicle mediated mitochondrial transfer in macrophage induced transdifferentiation will be analysed, the regulation of mitochondrial protein homeostasis by the quality control system will be examined. Meanwhile, the possibility of using mitochondrial DNA and protein from extracellular vesicles for the control, early diagnosis and prevention of silicosis will be explored.

肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞是矽肺发病的重要环节，其细胞器水平上机制尚不明确。转分化过程中细胞能量代谢活跃，线粒体很可能通过质量控制系统调节自身蛋白质平衡，并藉由胞外囊泡介导的细胞间转移参与此过程。因此，深入研究线粒体在转分化过程中的作用具有重要意义。本课题拟构建二氧化硅诱导的肺成纤维细胞转分化模型及实验性矽肺大鼠模型，结合人群流行病学调查，采用SILAC-based 质谱技术定量研究转分化前后细胞中及胞外囊泡中线粒体蛋白成分变化，绘制转分化前后线粒体蛋白图谱；采用蛋白质导入和降解实验、蓝绿温和胶、荧光标记、蛋白质过表达和RNA干扰等技术比较转分化前后线粒体蛋白稳态的改变，研究胞外囊泡内线粒体生物学特征及细胞间转移机制，分析线粒体对转分化的影响，增进对矽肺发生发展机制的了解，探索胞外囊泡中mtDNA和蛋白质作为矽肺监测和早期诊断指标的可能性，为矽肺的监测、诊断和干预提供理论依据和方法。

肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞是矽肺发病的重要环节。转分化过程中细胞能量代谢活跃，线粒体在其中所起的作用和调控机制尚不完全清楚。该项目原计划对胞外囊泡介导的线粒体转移在矽肺成纤维细胞转分化中的作用开展研究。项目开展初期，课题组尝试了各种培养及生化条件，仍无法从肺成纤维细胞培养上清中提取足量的可用于定量质谱分析的胞外囊泡。同时，在比较分析肺成纤维细胞转分化前后的定量质谱结果时，我们注意到线粒体叶酸代谢在成纤维细胞转分化前后变化显著，可能对肌成纤维细胞的形成起重要调控作用。随后，我们重点研究了线粒体叶酸转运蛋白SLC25A32和线粒体叶酸代谢关键酶MTHFD2，发现二者均对TGF-β诱导的肺成纤维细胞转分化起抑制作用，提示增强线粒体叶酸代谢可能抑制肌成纤维细胞的形成。我们随后研究了补充叶酸对肺成纤维细胞转分化的影响，发现添加叶酸可以上调MTHFD2和SLC25A32的表达水平，降低TGF-β诱导的氧化压力，同时抑制肌成纤维细胞标志性蛋白的表达。为了研究补充叶酸是否可以抑制矽肺形成，我们建立了实验性小鼠矽肺模型，发现补充叶酸可以促进线粒体叶酸代谢相关基因的表达，有效抑制肺组织中SiO2诱导的氧化压力和纤维化。综上所述，我们首次揭示了增强线粒体叶酸代谢可抑制TGF-β诱导的肺成纤维细胞转分化和SiO2诱导的肺纤维化，为矽肺临床治疗提供了新思路。