寡肽在奶牛小肠内的吸收机制及对其发育的影响

Dairy milk is a main source of protein in human diet. Milk protein content is a very important index for milk quality evaluation. Thus improvement of dairy milk protein content and yield has always been an important area for researchers. Peptide is one of the most important precursor of milk protein and can be absorbed intact by small intestine of lactating dairy cows. The absorption and utilization of peptide-bound amino acids for protein synthesis appears to be a general phenomenon. The mechanisms for absorption and the effect of oligopeptides on the development of small intestine are complicated and still unclear. Therefore, the objective of this project is to evaluate the molecular and cellular mechanisms of absorption of limiting amino acids-containing oligopeptides in bovine small intestine, and the effect of oligopeptides on the development of small intestine of dairy cow, using primary small intestinal epithelial cell culture model, Using chamber system, gene silence, isotope kinetic and animal trial. Knowledge of the absorption, utilization and function of small peptides in small intestine may provide new insights into protein metabolism and provide scientific basis for the application of small peptides in dairy cows.

乳蛋白作为人类食品蛋白的重要来源及牛乳质量的重要指标，其重要性一直受到研究者的广泛关注。寡肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前体物，并且能被胃肠道大量吸收。鉴于寡肽对奶牛营养的重要作用和奶牛胃肠道及乳腺组织能够吸收利用小肽的观点已逐渐被人们接受和认可，基于目前反刍动物寡肽吸收利用机制及寡肽功能的研究现状，本课题拟利用原代培养的奶牛肠上皮细胞体外模型及动物饲养试验，结合同位素示踪技术、U氏灌流系统和基因敲除等技术，在分子、细胞、组织和动物多水平研究奶牛小肠对同位素标记肽及含限制性氨基酸的常规肽的摄取机制及其对奶牛小肠发育的调控规律，为构建奶牛小肽及蛋白质营养提供理论依据，并为奶牛生产中小肽饲料的添加和新型蛋白质饲料的开发提供参考。

乳蛋白是人类重要的蛋白质来源，其吸收代谢一直是学者关注的焦点。但作为奶牛重要氮源及乳蛋白重要前体物的小肽，其在奶牛胃肠道的吸收代谢机制尚不清晰。本项目旨在利用体外原代培养的奶牛小肠上皮细胞模型，结合HPLC检测、Western blot、siRNA干扰等技术，在细胞、分子组织和动物多水平研究奶牛肠对模型肽及含限制性氨基酸的常规肽的吸收转运机制及其对奶犊牛生长发育的影响。本项目首先利用酶消化及相差贴壁法成功分离纯化并建立了奶犊牛小肠上皮细胞体外培养模型，并利用此模型研究发现小肽转运载体PepT1和紧密连接蛋白在小肠上皮细胞吸收二肽Gly-Sar和Met-Met过程中发挥着重要作用；利用上皮细胞的Transwell模型模拟肠上皮建立了跨膜转运模型，发现二肽Gly-Sar和Met-Met可完整穿过小肠上皮细胞屏障，其中Met-Met可部分分解，但具有抗水解作用，并发现载体PepT1、旁细胞途径和简单渗透扩散参与了转运，而胞吞作用未参与转运；然后，对发挥作用的肽载体基因PepT1进行了克隆表达，解析了其动力学参数（Km值0.94±0.06 mmol/L，且最大转运速度为20.80±1.74 nmol/（mg蛋白质•5分钟）），并发现其对短链、疏水性、负电荷或中性电荷肽具有强亲和性，具体高容量低亲和力特征；利用U氏灌流系统模型研究发现小肠组织可以完整吸收小肽，在组织内及浆膜测完整存在，并受温度、抑制剂、浓度影响，呈现温度浓度等环境依赖性。最后研究了小肽对奶犊牛生长发育的影响，发现日粮添加1%小肽提高了犊牛肠道完整性，并提高了犊牛生长性能和免疫性能（IgA、IgG），有利于小肠上皮分化，上调了营养物质转运载体PepT1和氨基酸载体等的表达，说明小肽营养是奶牛蛋白质营养的重要组成部分。此研究为构建奶犊牛小肠上皮的小肽吸收模型、完善奶牛蛋白质营养模式提供理论依据，并为奶犊牛生产中小肽饲料的添加和新型蛋白质饲料的开发提供了参考。