I型聚酮手性中心形成的分子机制研究

Polyketides are a large group of secondary metabolites with diverse bioactivities of which many have been clinically used as drugs. The presence of numerous methyl- and hydroxyl-bearing chiral centers is one of the most striking features of polyketides. During the biosynthesis of type I polyketides, a ketoreductase (KR) domain of a polyketide synthase module can stereospecifically reduce a β-keto to a D- or L-β-hydroxyl and epimerize a D-α-methyl to an L-α-methyl. Although several key residues that affect the stereochemical specificity of KR domains have been identified in our previous research, the detailed mechanism is still unclear. In this proposal, we will use a combination of structural biology, biochemistry, molecular biology, and bioinformatics approaches to elucidate the molecular basis of the stereochemical specificity of KR domains. Special emphasis will be placed on 1) solving the crystal structures of KR complexed with substrate by X-ray crystallography to identify residues involved in substrate binding; 2）elucidating the effects of these residues on stereochemical specificity of KR by site-directed mutagenesis and in vitro functional assay; 3) solving the crystal structures of KR mutants to reveal the conformation change of active site; and 4) generating polyketides with expected chiral centers in vivo using suitable microbial hosts by engineering KR stereochemical specificity with the resulting information.

聚酮是自然界中的一大类活性多样的次级代谢产物，是临床药物的重要来源。其明显的结构特征是具有多个羟基和甲基手性中心。I型聚酮的生物合成研究发现，聚酮合酶模块中的酮基还原酶（KR）结构域不仅可以把β-酮基特异性地还原为D-或L-型羟基，还可以把D-型α-甲基异构化为L-型，这是聚酮结构多样性的重要原因。我们前期的工作确定了KR催化中心影响立体化学特异性的几个关键氨基酸残基，但具体机制仍不清楚。本研究中，我们将综合利用结构生物学、生物化学、分子生物学以及生物信息学等手段系统探索KR立体化学特异性的分子机制。利用X射线晶体衍射技术解析KR和底物复合物的三维结构，确定催化中心参与底物结合的氨基酸残基；利用定点突变和体外功能分析验证其对KR立体化学特异性的影响；结晶KR突变体，分析催化中心的结构变化；最后，利用所得到的结果指导KR立体化学特异性的定向改造，在微生物体内合成具有预期手性中心的聚酮化合物。

聚酮是小分子药物的重要来源，具有多个甲基或羟基手性中心是其典型结构特征。本研究通过对聚酮合酶(PKS)模块中酰基转移酶(AT)、酮基还原酶（KR）和烯酰还原酶（ER）等结构域的结构和功能分析阐明手性中心形成的分子机制，为理性设计新聚酮提供基础。AT结构域负责选择特定的短链羧酸作为聚酮合成的前体。为研究AT的立体特异性，克隆表达阿维菌素PKS起始模块中的AT结构域(AveAT0)，手性气相色谱-质谱分析确定其特异性的选择(2L)-2-甲基丁酰-辅酶A。晶体结构分析显示AveAT0包含脱水酶亚结构域和类铁氧化还原蛋白亚结构域，底物结合孔道位于两个亚结构域的界面。对接模拟分析揭示催化组氨酸的空间位阻作用使得AveAT0只能识别2L-型底物。KR结构域不仅可以把C3-酮基立体特异性的还原为D-型或L-型羟基，还可以把D-型C2甲基异构化为L-型。对两性霉素PKS第二模块中KR（AmpKR2）、底物2-甲基-3-酮基-戊酰-泛酰巯基乙胺和辅因子NADP+的复合物晶体结构分析表明，底物在KR活性中心的结合方式决定还原产物中C3羟基的立体构型。该复合物结构也为通过分子动力学模拟研究C2甲基异构化的分子机制提供了基础。ER结构域在还原聚酮中间产物中双键的同时，设定C2甲基为D-型或L-型。为研究ER如何控制C2甲基的立体构型，合成了泛酰巯基乙胺和酰基载体蛋（ACP）衍生的反式2-甲基-巴豆酰基底物。2-甲基-巴豆酰-泛酰巯基乙胺的还原产物是D-型和L-型的混合物，然而2-甲基-巴豆酰-ACP只被还原成预期中的L-型产物。不同来源ER和ACP底物的组合会导致D-型产物的生成，说明ER还原反应的立体特异性依赖于其与相应ACP之间合适的蛋白相互作用。定点突变分析表明ER活性中心保守酪氨酸和赖氨酸参与控制产物中C2甲基的立体构型。