食品发酵过程酿酒酵母氮代谢物阻遏效应形成机制及其调控

影响我国传统发酵食品安全最为重要的因素是各种含氮化合物代谢生成的胺(氨)类物质，如氨基甲酸乙酯、亚硝胺类和生物胺类等。其中，氨基甲酸乙酯是最为重要的一种。本课题以国内产量较大的绍兴黄酒所用酿酒酵母菌株N85为研究对象，通过基因组测序和系统生物学分析，揭示导致酿酒酵母积累氨基甲酸乙酯及与其前体合成和积累相关的氮代谢物阻遏效应及其调控机制。在此基础上，通过食品安全级代谢工程改造消除氨基甲酸乙酯及其前体积累的分子基础得到氮代谢物阻遏效应显著弱化的工程菌株，结合依赖于酵母病毒的工程菌株原位置换技术，在不改变微生物群落结构的情况下消除野生型菌株。研究结果将为解决由于氮代谢物阻遏效应相关的含氮有害代谢物积累导致的普遍存在于发酵中的食品安全问题提供理论依据和技术支撑，对于打破国外针对我国传统发酵食品行业设置的技术壁垒、传承和发展中国特色食品文化具有重要的理论意义。

(1) 在21种常见氮源中寻找到了酿酒酵母N85菌株的7种偏好型氮源，并从中发现了造成菌株发酵过程中尿素积累的三种关键氮源(谷氨酰胺、谷氨酸和精氨酸)；通过定量PCR检测，发现了参与尿素代谢抑制调控的关键调控因子(Gln3p、Gat1p、Tor1p等)，并在此基础上提出了偏好型氮源对菌株尿素代谢产生抑制作用的机理。.(2) 以Gln3p的磷酸化调控方式为基础，对另外的三个GATA调控因子(Gat1p、Dal80p和Gzf3p)的胞内定位进行研究。通过序列比对和荧光蛋白融合表达技术，发现Dal80p和Gzf3p的胞内定位不受氮源调控的影响；而Gat1p的调控方式则与Gln3p相似。除此之外还发现了Gat1p的核定位序列、核定位调控序列以及核定位序列上的磷酸化位点。.(3) 在Gln3p和Gat1p核定位研究成果的基础上，尝试采用不同的策略对Gln3p和Gat1p进行了一系列的代谢改造(磷酸化位点的定点突变、核定位调控序列的缺失等)。实验结果表明，这些策略都可以在一定程度上缓解Gln3p和Gat1p所受的抑制调控，而联合使用这些策略能获得最佳的改造效果。效果最好的两株基因工程菌发酵48 h后的尿素积累量比对照菌株分别下降了37.4%和44.3%，说明对Gln3p和Gat1p的改造策略有继续用于改造N85生产菌株的潜力。.(4) 尝试通过对尿素代谢相关调控途径的代谢改造(去磷酸化调控、泛素化调控和Dal81p和Dal82p的激活作用)，降低模式菌株发酵过程中的尿素积累量。实验结果表明，强化胞内的去磷酸化调控作用的效果有限；而强化Dal81p和Dal82p的激活作用可以增强菌株尿素代谢的能力。此外，以尿素代谢相关调控因子的泛素化检测结果为基础，对Dal81p上的泛素化位点进行了定点突变。突变后Dal81p的激活作用更强，和Dal82p共同表达后能获得最佳的代谢改造效果。Dal81p和Dal82p共表达的基因工程菌株在48 h发酵的过程中尿素的积累量下降了55.7%。.(5) 将在模式菌株中获得良好效果的代谢改造策略应用于生产菌株N85，并在黄酒模拟体系中检测菌株的发酵特性和氨基甲酸乙酯产生量。实验结果表明，采用经代谢改造后的N85菌株，发酵过程中的尿素积累量和EC产生量都大幅下降(分别降低了63%和72%)，但发酵特性并未发生明显的改变。