新生隐球菌穿越脑微血管内皮细胞的下游信号转导通路

隐球菌脑膜炎（隐脑）在细胞免疫功能低下人群和正常人群的发病率近年均有升高的趋势。对隐脑高死亡率和高致残率的防治难有进展的主要原因在于对隐脑致病机制缺乏足够的了解。本课题依据前期工作基础，分别在cPLA2α,5-LO和CysLT1基因敲除小鼠整体动物模型及相应的小鼠或人脑微血管内皮细胞离体模型上，结合RNA干扰、药物阻断、蛋白免疫印迹、激光共聚焦荧光成像、免疫组化等手段评价cPLA2α，5-LO，CysLT1和PKCα等信号环节在新生隐球菌侵入脑内皮细胞中的作用，阐明相关的信号转导通路，寻找干预信号通路的靶位点，以便更全面了解隐病的致病机制，为隐病的防治提供新思路。其中，CysLT1靶位点是重点研究内容之一，CysLT1受体阻断剂Montelukast当前已经是临床上广泛应用于控制哮喘的国际首选的一线非激素抗炎药，本研究有望就Montelukast应用于隐病防治的可行性提供关键的实验依据。

隐球菌脑膜炎（隐脑）在细胞免疫功能低下人群和正常人群的发病率近年均有升高的趋势。对隐脑高死亡率和高致残率的防治难有进展的主要原因在于对隐脑致病机制缺乏足够的了解。本项研究首先制备了可稳定高表达GFP的新生隐球菌H99菌株H99-GFP，建立了定位隐球菌中枢感染部位的新方法。研究发现，新生隐球菌侵入下列脑区：初级运动皮层-次级运动皮层、纹状体、海马透明层、海马CA1区、背外侧膝状核、丘脑后外侧核的内外嘴侧部、压后皮层颗粒、次级视皮层、齿状回分子层、海马腔隙分子层，这项工作为深入研究新生隐球菌与脑细胞间的相互作用奠定重要基础。本项研究制备了CysLT1基因敲除小鼠，发现CysLT1在小鼠隐球菌中枢感染中发挥重要作用。CysLT1可被确定为重要靶点。采用静脉注射隐球菌的血源性脑膜炎实验模型，发现隐球菌侵入cPLA2α基因敲除小鼠脑组织的数量显著低于野生型对照组，说明cPLA2α在新生隐球菌入侵小鼠脑中起着重要作用。外加花生四烯酸（AA）可以模拟cPLA2α活性增强带来的代谢物AA增加， AA静脉注射组小鼠脑内H99的计数显著高于对照组，说明cPLA2α可能通过增加AA释放而增加H99入侵脑组织。而且，cPLA2α的阻断剂AACOCF3显著抑制H99跨人脑微血管内皮细胞(HBMEC )侵袭。免疫组化和免疫荧光实验显示小鼠脑组织血管内皮细胞及血管周围星型胶质细胞表达cPLA2 (尤其在大脑皮层和海马) 。在气管接种H99的实验性脑模型上，发现隐球菌侵入5-LO基因敲除小鼠脑组织的数量显著低于野生型对照组，说明5-LO在新生隐球菌入侵小鼠脑中起重要作用。进一步的离体细胞HBMEC转室(transwell)实验表明， FLAP的阻断剂MK886显著抑制H99跨内皮细胞侵袭。在HBMEC transwell实验中，CysLT1激动剂 LTD4引起H99跨内皮细胞侵袭的增强，而当转染腺病毒 Ad5CA dominant negative-PKC-α (DN)到HBMEC，这种增强作用消失，说明PKCα在隐球菌中枢感染中起重要作用，在信号通路中，PKCα处于cPLA2的下游。至此，本项研究发现，cPLA2-5-LO-CysLTs-CysLT1-PKCα信号通路在隐球菌中枢感染中发挥重要作用，CysLT1是其重要靶点之一。因此，本项研究深化了隐脑致病机制，为其防治提供重要依据。..