奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌多亚单位嵌合蛋白抗原表达及免疫原性研究

金黄色葡萄球菌（S.aureus）是奶牛乳房炎主要致病菌，由于耐药菌株大量出现，导致抗菌素疗效不佳。因此，使用疫苗预防S. aureus感染已成研究热点。以往研究的全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗及单一成分蛋白亚单位苗免疫保护效果均不理想。根据S. aureus多因子致病特点和以往研究结果，最近提出使用多抗原成分疫苗有望解决这一问题。可目前缺乏对不同抗原成分免疫效果比较研究，影响抗原成分选择；且缺乏对3种以上抗原的多抗原疫苗免疫研究。本项目拟通过对S. aureus 4种表面粘附素类抗原、4种菌体结构蛋白类抗原进行免疫研究后，各选择1种免疫保护效果好的抗原，同α溶血素一起，进一步研究选取各抗原的免疫优势片段，经融合表达制备含3种不同抗原免疫优势片段的嵌合蛋白，并研究其免疫保护作用。为进一步研究预防奶牛乳房炎S. aureus与链球菌多抗原嵌合苗和人类S. aureus苗提供参考。

金黄色葡萄球菌（S.aureus）不仅引起人类感染，也是奶牛乳房炎的主要致病菌。由于S.aureus耐药菌株大量出现和药物治疗造成奶中残留问题，用抗菌素防治S.aureus感染受到限制。因此，用疫苗预防S.aureus感染成研究热点。以往研究的全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗及单成分亚单位苗免疫保护效果均不理想。根据S.aureus致病机理和已有研究结果，提出多抗原亚单位苗有望解决这一问题。但在众多抗原中选择哪些抗原、如何来构建多抗原疫苗尚需研究。.本研究对S.aureus主要表面粘附素抗原ClfA、ClfB、FnbPA、Can和菌体蛋白抗原TRAP、IsdA、IsdB、GapC分别进行免疫原性比较研究，根据免疫小鼠攻毒、抗体水平及细胞因子水平检测结果，选择表面粘附素FnbpA和菌体蛋白Trap作为候选抗原，并与α溶血素（Hla）一起构建多抗原疫苗。同时，我们比较研究了IsdB免疫优势片段（tIsdB）与Trap的嵌合蛋白（tIsdB-Trap）、IsdB、Trap以及IsdB与Trap混合（tIsdB+Trap）的免疫保护效果，结果证明tIsdB-Trap嵌合蛋白免疫保护效果好于其他各组。因此，构建Trap、Hla和FnbpA嵌合蛋白。.为确保Trap、Hla和FnbPA嵌合蛋白有效表达，对分子量较大的Hla和FnbPA免疫优势片段进行筛选。经生物信息学分析后，表达Hla毒性失活突变（HlaH35L）、Hla1-50aa、Hla5-76aa、Hla158-218aa和HlaD（Hla5-76aa与Hla158-218aa融合）片段，用小鼠肺炎模型证实HlaD免疫保护效果近于HlaH35L蛋白；表达FnbPA和FnbPA301-430aa、FnbPA801-874aa以及FL（FnbPA301-430aa与801-874aa融合）片段，用小鼠败血症模型证实，FL免疫保护效果近于FnbPA全蛋白。在此基础上，将Trap、HlaD和FL进行融合表达，并将该嵌合蛋白（TAF）免疫小鼠，并设Trap、HlaD、FL以及这三种蛋白混合对照组，通过免疫小鼠攻毒、血清抗体、调理吞噬、细胞因子（INF-γ、IL-4、IL-17等）检测等证实，多抗原嵌合蛋白TAF免疫保护效果好于其他各组，为深入研究预防S. aureus感染疫苗提供参考。