萜类化合物MEP合成途径关键前体供给的人工调控

Glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) and pyruvate are two key precursors of MEP pathway, which is the common synthetic pathway of terpenoids compounds. Balanced supply of G3P and pyruvate is very important to obtain an efficient terpenoids synthetic pathway. These two precursors are metabolites of the central glycolysis pathway. Because G3P is continuously converted to pyruvate, it is very difficult to obtain balanced supply of these two precursors using traditional glycolysis pathway. In this project, glycerol is used as the carbon source and a novel glycerol metabolic pathway will be created for pyruvate supply. Traditional glycerol metabolic pathway will be used for G3P supply, and the connection between G3P and pyruvate will be disrupted. Rate limiting steps of these two glycerol metabolic pathways will be identified, and genome editing technologies will be used to modulate expression of these rate limiting genes. The best combination for terpenoids synthesis will be identified. In addition, carbon flux analysis will be performed, as well as measurement of key metabolites concentrations. The relationship between the ratio of G3P and pyruvate, carbon flux distribution and terpenoids synthesis will be identified. The new artificial regulation strategy will facilitate characterization of the regulating mechanism of G3P and pyruvate for terpenoids synthesis.

3-磷酸甘油醛和丙酮酸是萜类化合物MEP通用合成途径的关键前体。如何实现这两个代谢物的平衡供给是萜类化合物高效合成的关键。3-磷酸甘油醛和丙酮酸是糖酵解中央代谢途径的代谢物。由于3-磷酸甘油醛会被持续不断地转化为丙酮酸，因此传统糖酵解途径很难实现3-磷酸甘油醛和丙酮酸的平衡供给。本项目拟以甘油为碳源，引入甘油新代谢途径提供丙酮酸，通过甘油传统代谢途径提供3-磷酸甘油醛并阻断其和丙酮酸之间的偶联。在此基础上，鉴定新旧两条甘油代谢途径的限速步骤，并用基因组编辑技术对这两条途径中的限速酶基因进行同时调控，筛选出最利于萜类化合物合成的组合。最后，基于碳代谢流和代谢中间物浓度分析，解析3-磷酸甘油醛和丙酮酸的比例及碳代谢流分布和萜类化合物合成之间的相互关系。本项目创建的3-磷酸甘油醛和丙酮酸平衡供给的新型人工调控策略有助于解析这两个关键前体对萜类化合物合成的调控机制。

β-胡萝卜素是体内维生素A的重要来源，具有预防“3C”即癌症、心血管疾病和白内障、提高机体免疫功能的作用，在医药、食品等领域有广阔的应用前景。随着生物技术的不断发展，利用大肠杆菌生成β-胡萝卜素的方法也越来越受人们的推崇。本项目以甘油为碳源，对甘油代谢途径进行优化，另外克隆外源甘油代谢途径，并使协同表达两个代谢途径的关键基因，提高β-胡萝卜素产量。.主要研究结果如下：.（1）传统甘油代谢途径的优化.首先对甘油代谢途径的8个基因进行mRSL文库调控，并研究各基因转录水平与β-胡萝卜素产量的关系；其中glpF、tpiA和glpD建库调控β-胡萝卜素产量最高菌株分别比对照提高1.56、1.96和2.87倍，转录水平测定表明，降低glpD、glpF、tpiA的转录水平有利于β-胡萝卜素的生成。初步鉴定出甘油代谢途径的关键限速基因是glpD。然后以glpD-2为出发菌，对甘油代谢途径其它限速步骤进行鉴定，结果表明，pykA和gpmA可能是传统甘油代谢途径的又一限速步骤。.（2）外源甘油代谢途径的优化.利用醛还原酶和醛脱氢酶的好氧发酵的糖酵解来替代甘油的代谢途径，引入可将甘油转化成甘油酸的AldH和AlrD酶后，β-胡萝卜素产量增加50％。同时用一步法对新途径的gark、glxk、eno、pykA、pykF进行建库调控。调节garK基因表达，β-胡萝卜素产量提高了13％。.（3）两种代谢途径部分解偶联.本项目敲除gpmA，部分解除新甘油代谢途径和传统甘油代谢途径直间的偶联，β-胡萝卜素产量提高118％。共调节甘油代谢新途径和传统途径关键基因，得到新旧途径协调表达菌株KH008，其β-胡萝卜素产量比KH001高3.5倍。.（4）经过代谢组学分析表明，β-胡萝卜素产量和G3P/Pry值没有太大关系，而是和中央代谢活性有关。.本项目研究表明甘油是萜类化合物的优先底物，引入甘油代谢新途径可以有效提高萜类化合物的产量。大肠杆菌中MEP途径受到严格调控，寻找调控节点，活化中央代谢途径，是提高大肠杆菌经MEP途径合成萜类化合物的有效策略。