仿刺参体腔细胞酚氧化酶的特性与病害预警功能研究

Phenoloxidase (PO), mainly found in coelomic fluid, is one of the most important innate immune factors in echinoderm. Presently, we have achieved the puification of three POs from coelomocytes of Apostichopus japonicus and obtained the partical cDNA sequences of three POs by transcriptome sequencing analysis. In this project, using purified POs, the biochemical, enzymatic and antibacterial characteristics of POs will be studied. Meanwhile, based on the partial cDNA sequences of POs, the full-length cDNA of each PO will be amplified and subsequently employed for protein expression and monoclonal antibodies (mAb) production. Using the cDNA sequences and mAbs, the distribution of each PO in different tissues and coelomocytes of adult holothurian, the occurrence and distribution of PO during development (from fertilized egg to juvenile stage), the alteration of holothurian on immune and physiological status after gene silencing for each PO, and the variation of each PO after pathogens challenge will be studied. On these bases, we analyze the immune and physiological characteristics and the functional differentiation of each PO, illustrate the connections between resoponse reactions in vivo and antibacterial characteristics in vitro for each PO, explore the the early-warning role played by each PO after pathogens infection, and thereby accumulate knowledges on the immune and physiological functions of A. japonicus POs.

酚氧化酶（PO）是棘皮动物非特异性免疫的重要组成因子，主要分布在棘皮动物的体腔液中。申请人目前分离纯化了仿刺参体腔细胞中的3种PO，通过转录组测序获得了3种PO的部分cDNA序列。本项目拟通过纯化的PO，了解这些酶的生化、酶学特性，弄清不同PO体外氧化产物的抗菌特性；拟根据PO的部分cDNA序列，扩增不同PO的cDNA全长，用PO序列表达蛋白，制备不同PO的单克隆抗体；通过不同PO的序列和单克隆抗体，确定各PO在仿刺参成体的不同组织和不同类型体腔细胞中的表达分布以及在发育过程中（从受精卵到稚参）的出现时期和分布特点，弄清不同PO基因沉默后仿刺参的免疫生理变化以及不同病原感染后各PO的表达变化规律。在此基础上，分析不同PO的免疫、生理特性与功能分化，弄清各PO体内免疫应答反应和体外抗菌特性间的联系，探究各PO在仿刺参受病原感染时的预警指示作用，积累仿刺参PO免疫与生理功能研究的资料。

本项目通过生化方法从仿刺参幼参的体腔细胞中鉴定并分离纯化出3种酚氧化酶（PO），分别命名为AjPO1、AjPO2和AjPO3。生化与酶学特性分析显示，AjPO1、AjPO2和AjPO3在催化产物颜色、最适温度和pH、反应动力学参数上差异显著，但均属于含铜的金属酶，均可被Ca2+、Mg2+和Mn2+激活。抗菌特性分析显示，以L-DOPA或多巴胺为底物，AjPO1、AjPO2和AjPO3的氧化产物分别呈现不同的抗菌谱。上述结果表明，AjPO1、AjPO2和AjPO3在所承担的生理与免疫功能上可能存在较大差异，并且二价金属离子在仿刺参PO系统的功能调节中可能发挥重要作用。. 通过分子生物学技术从仿刺参幼参体腔细胞中克隆出3种PO（分别命名为AjPOI、AjPOII和AjPOIII）的cDNA全长，并利用免疫学技术分别制备了3种PO的单克隆抗体。mRNA和蛋白两种水平的检测均显示，3种PO在仿刺参的不同组织和不同发育阶段幼体中都有表达，其中AjPOI在体腔细胞中表达量最高，而AjPOII和AjPOIII在体壁中表达量最高，3种PO均在中耳幼体期表达量相对较低，表明在免疫和生理功能上，AjPOII和AjPOIII可能相对接近，而仿刺参在中耳幼体阶段病害多发，很可能与PO系统的低表达有关。基因沉默分析显示，AjPOI对仿刺参体腔液PO总活力的影响要大于AjPOII以及AjPOIII的影响，表明相对于AjPOII和AjPOIII，AjPOI可能在仿刺参非特异性免疫和生理中发挥更为关键的作用。mRNA水平的免疫应答特性分析显示，3种PO具有不同的应答菌谱，均与Toll样受体的表达显著相关，3种PO之间仅 AjPOII和AjPOIII的表达显著相关，表明3种PO在免疫功能上具有明显的分化，其中AjPOII和AjPOIII相对接近，并且3种PO免疫应答功能的启动很可能与Toll样受体相关。蛋白水平的免疫应答特性分析显示，灿烂弧菌、假交替单胞菌、希瓦氏菌和蜡样芽胞杆菌分别刺激后的96 h内，体腔液上清中AjPOII的含量在多个时间点显著升高，显示出AjPOII作为生物标志物在病原菌侵染预警上的应用价值，据此，本项目通过ELISA技术开发制备了仿刺参幼参病原菌侵染预警试剂盒，为科学有效防控仿刺参细菌性病害的发生和传播提供了有力的技术支撑。