绿色生态法制备生物保鲜剂纳米银粒子的酶学机理

Food spoilage is a serious problem in food industry, resulting of the development of safe and effective preservatives. Being a wide-spectrum and nontoxic antimicrobial agent, silver nanoparticles (AgNPs) are paid more concerns by researchers. Although various physical and chemical procedures were used to generate AgNPs, the stability and the residue of toxic chemicals are the subjects of paramount concern. Hence, eco-friendly methods for AgNPs synthesis deserve merit. However, the mechanism for the biosynthesis is not clear yet. Endophytic fungi are special microorganisms on the basis of taxology, presenting various unique functions. This project aims to purify and identify the enzymes from an endophytic fungus Fusarium oxysporum BH-3 which can biosysthesize AgNPs. The effect of amino acid residues in the enzyme, co-factors and other conditions on the production and characteristics of AgNPs will be studied. Through the execution of the project, the mechanism of the biosynthesis of AgNPs will be clarified, which can provide the theoretical support for the production of AgNPs using purified enzyme, and had a significant meaning for the synthesis of AgNPs eco-friendly and biocompatibly.

食品腐败是食品工业的一个热点问题，绿色、高效、安全的食品保鲜剂的开发应用是解决食品腐败的重要手段。纳米银是一种广谱、无生物毒性的抗菌材料，近年来受到各国研究者的关注。虽然目前已有多种物理或化学法制备纳米颗粒，但存在着产物稳定性差和毒性试剂残留等缺点。绿色生物法制备具有很多优势，但目前机理还不明确。植物内生真菌是一种分类学上比较特殊的生物材料，具有多种新颖独特的功能，本研究拟纯化并鉴定百合内生真菌Fusarium oxysporum BH-3代谢产物中具有还原纳米银粒子(AgNPs)功能的酶组分，分析酶结构中氨基酸残基、辅因子以及环境条件对纳米银粒子产量和粒径等特性的影响，研究AgNPs合成的关键调控因子。通过本项目的实施，可以揭示AgNPs的生物制备机理，为进一步采用纯化酶合成AgNPs提供理论依据，对发展绿色生态法制备AgNPs具有重大的意义。

纳米银是一种广谱、安全、高效的抗菌材料，但目前商业应用的物理或化学法制备纳米颗粒，存在着成本高、稳定性差和毒性试剂残留等缺点。本项目采用真菌代谢产物绿色生物法制备纳米银粒子，研究内容和主要结果如下：.（1）分离得到一株石斛内生真菌DO-1，鉴定为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），菌体在去离子水中浸泡后分泌的代谢产物能还原银离子产生具有抗菌活性的纳米银。.（2）F.graminearum DO-1制备纳米银的最佳条件为pH 7、AgNO3 终浓度1 mM、80 ºC、黑暗条件、时间3 h，获得的纳米银粒子具有较高的抑菌活性，在440-450 nm具有特征性等离子吸收峰。.（3）采用透射电镜观察制备的纳米粒子，形状为球形，直径范围2-50 nm，具有典型的表面晶格条纹。.（4）产物的X-射线衍射图谱显示2θ(Degree)值分别对应于纳米银特征性晶面（111）、（200）、（220）、（311）。扫描电子显微镜/X射线能谱（SEM-EDS）结果显示纳米银粉末中除Ag外，还存在Na、O、C、S等元素，说明纳米银溶胶中除了纳米银粒子，还有蛋白或其他成分作为保护成分，维持纳米溶胶体系的稳定。.（5）采用Zeta电位仪进行纳米溶胶的表面电势、粒径及多分散性指数的研究，纳米银粒子生物活性与电位、粒径大小以及稳定性之间并不是简单的正相关或负相关性，高温条件虽然能增加反应速率，但纳米溶胶体系的稳定性显著降低。.（6）经分离纯化获得一个具有还原纳米银活性的阳离子型短肽组分，氨基酸序列为MVKKTSAV，分子量为863.52 Da，含脂肪族胺基团，起着还原纳米银粒子及维持稳定性的作用。.（7）傅里叶变换红外光谱结果显示活性肽与纳米粒子之间可能通过游离氨基基团或半胱氨酸残基发生作用，或者通过酶上带负电荷的羧基基团的静电吸引作用。.（8）纳米银作用于腐败菌能破坏菌体细胞膜，使胞内蛋白质等紫外吸收物质及钾离子溶出，且表现出良好的缓释性能，具有很好的应用价值。.通过本项目的实施，在分子水平上阐明AgNPs的生物制备机理，为进一步合成活性肽制备AgNPs提供理论依据，对发展绿色生态法制备AgNPs具有重大的意义。