猕猴桃乙烯响应因子ERF类涝害响应基因的功能研究

Root system of Actinidia is shallow and fleshy, and sensitive to water stress and extremely prone to waterlogging. Previous studies had showed that A. valvata had very strong waterlogging tolerance among 12 germplasm resources, belonged to 6 species of this genus, and had well graft compatibility to A. chinensis var. deliciosa, A. chinensis and A. arguta, and was a valuable material for kiwifruit rootstock breeding. Waterlogged root transcriptome of A. valvata is analyzed by high-throughput sequencing, and we focus on the differentially expressed genes of ethylene response factor (ERF), and select HRE1 (ERF-VII subfamily from Arabidopsis thaliana) as the reference gene, and confirm the candidate gene through quantitative-PCR identifying, and name the gene as AvERF1. Tissue specific expression of AvERF1 is analyzed under waterlogging, and using transient transformation of tobacco to study the subcellular localization, and through yeast one-hybrid technique to identify the transcriptional activity. By Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation, AvERF1 gene is transferred into susceptible cultivar ‘Hongyang’ of A. chinensis to validate gene function. To excavate waterlogging tolerance mechanisms of AvERF1 gene, we will compare the differences in growth and morphology, sucrose and ATP contents, anaerobic fermentation pathway, and recovery growth after removing waterlogging between transgenic and non-transgenic lines of Hongyang, accompanying with the complementary verification of Arabidopsis mutants. This study can deepen the understanding and research of ERF waterlogging tolerance gene in kiwifruit, and provide resistant material and theoretical basis to breed new kiwifruit variety or rootstock.

猕猴桃属植物的根系属于浅根系肉质根，对水分敏感，极易发生涝害。对该属6个种共12份种质资源的鉴定中发现对萼猕猴桃具有很强的耐涝性，与美味、中华和软枣猕猴桃均具有良好的嫁接亲和性，是非常有价值的砧木育种材料。利用高通量测序对其根系涝害转录组进行测定，重点关注乙烯响应因子ERF类差异表达基因，以拟南芥HRE1基因（ERF-VII亚家族）为参考，结合定量PCR验证确定候选基因，命名为AvERF1，分析其组织特异表达，利用烟草转化研究其亚细胞定位，通过酵母单杂交鉴定其转录活性，借助农杆菌介导的遗传转化，将其转入不耐涝的中华猕猴桃‘红阳’中进行功能鉴定：分析涝害胁迫下转基因和对照植株在生长形态、蔗糖和ATP含量、厌氧发酵通路及恢复生长等方面的差异，同时通过拟南芥突变体的互补验证，初步解析其调控机制。本研究可加深对猕猴桃ERF类耐涝基因的理解和研究，也可为耐涝新品种或砧木的培育提供抗性材料和理论依据。

我国南方猕猴桃产区，如四川、湖南、湖北、贵州等地普遍存在年均降雨量大、土壤粘重、易发生果园涝害等不利因素，因此，开展耐涝猕猴桃种质资源的筛选、发掘抗逆基因并解析其调控机理已成为猕猴桃抗逆研究的重点。植物耐涝性的研究主要集中在乙烯响应因子ERF类涝害基因的功能研究及调控机理解析。已报道的主要耐涝基因包括水稻的Sub1A基因、SK1和SK2基因，以及拟南芥的HRE1、HRE2、RAP2.2、RAP2.3 和RAP2.12基因，这8个基因均属于ERF第Ⅶ亚家族的成员。.本研究在种质资源筛选的基础上，获得1份耐涝性极强的对萼猕猴桃（Actinidia. valvata）资源KR5，根系完全淹水14天后依然能够萌发新稍和保持生长，因此，将其作为重点研究对象，利用高通量测序及转基因等技术开展该资源的抗性基因发掘及功能研究，主要内容包括：（1）对萼猕猴桃ERF类涝害响应基因的分析及候选基因的确定；（2）对萼猕猴桃AvERF候选基因的分离及生物信息学分析；（3）AvERF候选基因的亚细胞定位研究；（4）AvERF候选基因的转录活性分析；（5）AvERF候选基因的功能鉴定及调控机理研究。.通过项目执行，利用二代和三代转录组测序，从对萼猕猴桃中共鉴定出131个ERF基因，受涝害诱导表达量显著上升的第Ⅶ亚家族成员有6个，对这6个成员在抗、感资源中的表达分析，鉴定出2个候选基因AvERF73和AvERF78，通过烟草和拟南芥原生质体的瞬时转化，明确这2个基因均定位在细胞核中；通过转录自激活试验证实这2个基因都具有转录活性，是典型的转录因子。拟南芥的遗传转化证实这2个基因都具有增强转基因植株耐涝性的功能；根癌农杆菌介导的红阳猕猴桃的遗传转化已获得转AvERF73基因的阳性植株，涝害胁迫下地上部和地下部的受害症状均较轻，转基因植株的叶绿素荧光显著高于对照，下游4个重要调控基因ADH1、ADH2、PDC1和PDC2的表达量均显著上调，表明AvERF73基因的耐涝调控功能。本研究将为深入理解猕猴桃属植物对涝害胁迫的响应及耐涝性研究提供新思路，并为果树抗逆基因工程育种提供新的基因资源。