亮氨酸调节断奶仔猪肠道粘液蛋白合成及其机制的研究

As one of functional amino acids, leucine can stimulate the protein synthesis of the intestine, and significantly increase the utility of threonine in the intestine. Theronine is a main composition of mucins that are a important part of intestinal barrier function. However, it is unknown whether leucine can regulate the synthesis of the intestinal mucin. In this study, the weaning piglet, and the intestinal epithelial cell and goblet cell are utilized as the in vivo and in vitro models, respectively. By using the techniques of isotope tracer, quantitative real-time PCR, ELISA, immunohistochemistry, immunocytochemistry and Western Blot, we will study the effect of leucine on the synthesis of the intestinal mucin, and the protective effect of leucine on intestine of weaning piglets attacked by E.coli. Moreover, we will initially determine the mechnism of leucine regulating the synthesis of the intestinal mucin by the research of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway, which is one of the most important pathways of intracellular protein metabolism. These experiments will reveal the effect of leucine on maintaining intestine barrier function, which will be the important theoretical basis that leucine can increase the capability of disease resistance in piglets. This study also is of great value for the application of leucine curing the intestinal dysplasia of infant.

亮氨酸是机体内重要的功能性氨基酸，可刺激机体肠道的蛋白质合成，同时显著提高肠道对日粮中苏氨酸的利用。而苏氨酸是粘液蛋白（肠道屏障功能重要组成部分）的主要组成氨基酸。但对于亮氨酸是否能调节肠道粘液蛋白合成仍不清楚。本研究分别以肠道上皮细胞与杯状细胞和断奶仔猪为体外和体内试验模型，结合同位素示踪、实时荧光定量PCR、ELISA、免疫组织化学、免疫细胞化学和Western Blot等技术，研究亮氨酸处理对于肠道粘液蛋白合成的影响，以及在大肠杆菌感染的情况下，亮氨酸对肠道粘液蛋白合成的影响及其对断奶仔猪肠道的保护作用；同时结合细胞蛋白代谢相关的PI3K-Akt-mTOR信号通路研究，初步探讨亮氨酸调节粘液蛋白合成的细胞内分子机制。目的在于揭示亮氨酸在维持肠道屏障功能中的作用，为其在生产上应用于提高仔猪抗病能力提供科学依据，并对亮氨酸在临床上应用于婴幼儿肠道发育不良的治疗有重要理论意义。

本项目通过5个体内外试验探讨了亮氨酸处理对断奶仔猪小肠粘液蛋白合成的影响及其机制。项目执行初期，以苏氨酸为处理物，验证了饲粮中适当补充苏氨酸可显著提高仔猪小肠粘液蛋白合成，而这一过程可能受到了转录水平（mRNA）和翻译水平（PI3K-Akt-mTOR信号通路）的调控，为试验的进一步开展奠定了基础；而在仔猪饲粮中补充不同水平亮氨酸的研究表明，饲粮中补充过量的亮氨酸（2%）会严重影响断奶仔猪采食量，进而使仔猪无法正常生长，但适量补充亮氨酸（1%）可在一定程度上改善断奶仔猪的生长性能，并能提高其小肠中杯状细胞数量和粘液蛋白（mucin 1和mucin 2）的含量，在对小肠粘膜的研究也发现亮氨酸对粘液蛋白mRNA水平无显著影响，但显著激活了PI3K-Akt-mTOR信号通路；在轮状病毒攻毒建立了腹泻模型的基础上，研究发现饲粮中1%亮氨酸的补充可通过提高小肠杯状细胞数量和粘液蛋白水平，改善小肠形态结构，降低仔猪的腹泻，进而提高了断奶仔猪的生长性能，而这一过程中PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性可能起着重要的调控作用；为了进一步探明PI3K-Akt-mTOR信号通路在亮氨酸调控粘液蛋白表达过程中的作用，本研究以LS174T细胞为体外研究对象，引入了PI3K-Akt-mTOR信号通路的抑制剂Wortmanin和Rapamycin处理，结果表明，亮氨酸刺激LS174T细胞中粘液蛋白的表达，而Wortmanin和Rapamycin预处理完全抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路活性，并可显著抑制亮氨酸刺激的粘液蛋白表达，在一定程度上说明亮氨酸对粘液蛋白表达的刺激作用与PI3K-Akt-mTOR信号通路有关，但还存在了其它的调控方式；那么，本研究最后设计了一个细胞试验（以IPEC-J2细胞为对象），进行了蛋白质组学分析，结果表明，亮氨酸处理还可调节细胞外信号传递、激酶活化和磷酸化、转录因子的合成、DNA复制、转录复合体形成、钙离子调控过程以及细胞增殖和凋亡等信号通路。因此，根据本项目的相关研究表明，亮氨酸处理可以改善断奶仔猪的生长性能，并可缓解轮状病毒诱导的腹泻，而这与其可提高仔猪小肠杯状细胞数量和粘液蛋白的合成与分泌有关，且这一过程主要受到了PI3K-Akt-mTOR信号通路的调节作用，但蛋白组学分析还表明这一过程涉及到了细胞的其它调节通路，有待于深入探究。