FNMs-DNA条形码双增敏电化学分析技术在消化道多重病原体感染检测中的应用基础研究

The delayed diagnosis of pathogens has been leaded by some limitations for the detection methods, including time-consuming, low sensitivity and low detection rate. Currently, electrochemical technology with unique advantages has attended great attention for pathogenic microorganisms’ detection. The hotpot of electrochemical technology research is effectively improvement of the detection sensitivity. Normally, enzyme catalysis was used in these studies to improve sensitivity. On this way, we have prepared some electrochemical immunosensors based on nano-materials and enzyme and studied the application of these immunosensors for the detection of EHC O157:H7. Improvements are still required because of easily deactivation of enzyme and limited sensitivity increased with enzyme. Here, EHEC O157: H7 and cholera bacteria were used as a model in this project. Firstly, functionalized nano-particles were modified with abundance of metal compounds (MS)/bio-barcodes with identification for different targets. The synchronous detection using anodic stripping voltammetry was based on peak current on different potential for different MS/DNA barcodes. Furthermore, the sensitivity of the studied electrochemical immunosensor was improved further based on the application of stem-loop DNA probes and constituted DNA barcode cycle system. The study will provide a new technology for the pathogens and other pathogenic microorganisms detection based on ultra sensitive synchronous detection.

消化道致病菌严重威胁人类健康，现有检测方法存在鉴定耗时、灵敏度低、假阳性率高等缺陷，导致病原体感染诊疗滞后。电化学传感技术检测快速、灵敏度高，在病原微生物检测方面具有独特优势。前期，我们利用纳米材料和酶信号放大技术构建了电化学免疫传感器，并用于肠出血性大肠杆菌O157：H7的检测，研究发现酶易失活，灵敏度提高有限。基于此，本项目拟以肠出血性大肠杆菌O157：H7和霍乱为检测模型，设计不同病原体的特异性金属化合物（MS）/DNA条形码，利用功能化纳米材料（FNMs）大的比表面积固定高丰度的MS/DNA条形码，构建高效双增敏电化学检测技术，结合MS/DNA条形码的高特异性，旨在实现消化道多重病原体感染的超敏、联合同步检测。在此基础上，引入“茎-环”DNA探针，与DNA条形码构成循环放大系统以期实现痕量甚至单个病原体的检测。本研究将为临床上其它病原微生物的超敏、联合同步检测提供借鉴和启发。

病原微生物是威胁人类健康和造成社会恐慌的重要因素之一。目前，常规的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学检测法和分子生物学法。传统的培养法被认为是“金标准”，常用作对照方法。但该法耗时费力、对培养环境和操作人员要求严格，不适宜病原微生物的快速诊断。免疫学检测方法较培养法更加特异和快速，是一种可以定性和定量的综合技术，但是免疫检测存在“窗口期”假阴性问题而造成漏诊。聚合酶链反应（PCR）及其衍生技术具有极高的灵敏度，应用已极为广泛，但该方法易交叉污染，导致结果假阳性，并且 PCR 扩增也同时会对检测中的错误起到放大作用，从而降低方法的准确性和特异性。因此，寻找一种快速、准确、高灵敏鉴定病原微生物的检测方案，对病原微生物的临床早期诊断和治疗以及流行病学研究具有重要意义。电化学生物传感技术是将生物分子的特异性识别与高灵敏的传感技术相结合而发展起来的新型检测技术，已广泛应用在临床各个领域。与传统的检测技术相比，电化学生物传感技术具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、可实时检测等优点，是检测病原微生物早期感染的理想手段。基于目前生物分子检测的研究现状，结合电化学生物传感器的优点，本课题创新地设计了用于消化道病原微生物检测和分析的高灵敏、快速、并行检测电化学生物传感器技术。研究结果不仅拓展了电化学生物传感器液相检测的应用范围，而且为临床生物分子检测提供了一种全新的方法和思路。具体研究内容如下：（1）DNA步行器引发RCA@HCR三重级联核酸扩增方法的构建，（2）基于三重级联核酸扩增的高灵敏电化学生物传感器检测消化道病原微生物E. coli O157:H7关键技术的实验研究，（3）自主研发磁控电化学流动池检测系统，（4）双组份磁控电化学生物传感器分析检测技术，并行检测E. coli O157:H7和Vibrio cholera O1关键技术的实验研究。研究结果为临床疾病的早期诊断、病情进展、预后判断以及发病机制研究提供了一种灵敏、准确、特异、简便、快速的病原微生物检测分析技术。