转录因子Snail调控的miR-133b在结直肠癌中的生物学功能与调控机制

Transcription factor and microRNA (miRNA) are the biggest families of trans-acting factors in multicellular specimens. Their combinational regulation contributes to the elaborate genomic information. In this project proposal, we will clarify the direct regulation of Snail on miR-133b and report a new target mRNA and some signaling pathways of miR-133b in colorectal cancer with applying a series of cell biological and molecular biological techniques and methods, such as miRNA (human) qPCR Array, whole genome gene expression microarray, bioinformatics analysis, real-time PCR, western blot, dual-luciferase assay, site-directed mutagenesis, chromatin immunoprecipitation (ChIP), in situ hybridization (ISH) and immunohistochemistry staining. Moreover, cell proliferation, apoptosis, invasion, migration and nude mice tumorigenesis experiments will be performed to evaluate the biological functions of miR-133b in the progression and metastasis in colorectal cancer. The potential molecular mechanism will also be determined. After that, a new molecular mechanism of colorectal cancer tumorigenesis and metastasis will be revealed from a new understanding with the nature of genes and gene regulation, which will provide new ideas for the early prognosis and treatment of colorectal cancer.

转录因子和microRNA（miRNA）是多细胞物种中最大的基因表达调控的反式作用因子家族，它们的组合表达调控装置造就了精细的基因组信息。本项目拟通过"转录因子-miRNA-miRNA靶基因"调控模型，运用miRNA (human) qPCR Array、全基因组表达谱芯片、生物信息学分析、real-time PCR、western blot、双荧光素酶报告基因系统、定点突变、ChIP、原位杂交、免疫组化等一系列细胞生物学和分子生物学技术和方法，阐明Snail对miR-133b的直接调控作用，探索miR-133b新的靶基因及相关信号通路；通过细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和裸鼠成瘤等一系列功能实验探索miR-133b在结直肠癌发生和转移中的生物学功能，并进一步探讨其分子机制。从新的认识基因和基因表达调节本质的角度，揭示结直肠癌发生和转移的新的分子机制，为其早发现和早治疗提供新思路。

转录因子和miRNA是多细胞物种中最大的基因表达调控的反式作用因子家族，它们的组合表达调控装置造就了精细的基因组信息。Snail作为转录因子能够诱发上皮-间质转变（EMT），在肿瘤粘附、侵袭和转移过程中发挥重要作用。本项目运用miRNA qPCR Array等方法锁定Snail靶标兴趣miRNA——miR-133b；发现miR-133b在结直肠癌（CRC）表达水平较正常肠粘膜明显降低。通过一系列功能实验发现过表达miR-133b能够显著抑制CRC细胞的增殖、非锚定性生长、侵袭和转移，而对细胞凋亡影响不大；miR-133b表达水平与EMT上皮性标志分子CD1、CAV2呈正相关，而与间质性标志分子（VIM、CDH2、MMP9）及转录因子SLUG、TWIST、ZEB表达呈负相关。体内实验提示：过表达miR-133b显著抑制能够裸鼠成瘤能力及肝转移能力。运用TargetScan、Pictar和miRanda预测miR-133b潜在靶基因，验证了miR-133b对MAML1的直接转录调控作用，并发现MAML1在结直肠癌呈过表达，miR-133b与MAML1表达呈显著负相关。另一方面，在2种miR-133b过表达的结直肠癌细胞株中，运用Agilent全基因组表达谱芯片分析，并将上述两细胞系芯片结果中升高>1.5倍的重叠基因与miRecord（该库共含11个不同的生物信息学软件，我们取至少4个软件均包含的基因进行研究）预测的miR-133b靶基因交叉，发现共有22个交集基因，主要参与血管生成、血管形态发生等功能（后续研究将以新项目形式展开）。本项目研究结果提示：（1）miR-133b在结直肠癌组织、细胞系中表达显著降低，在CRC发生和转移中起重要作用，有可能成为CRC预后的新指标和治疗靶点；（2）miR-133b能够直接转录调控MAML1。