椎体血管异常克隆性分析及Tie2基因突变在其发病中的作用及机制

The incidence of vascular anomalies in vertebral are high, vertebral vascular anomalies are usually named as hemangioma,according to current view ,most of them are vascular malformations , our study find the immunostain result of GLUT-1,ki-67,VEGF protein is different obviously in hemangioma and vascular malformations,this "misdiagnosis" may lead to the confusion in the treatment, so it has important significence for reasonable treatment to clear whether vertebral vascular anomalies are real neoplasm or vascular malformations and its mechanism, In this subject, we will clear whether vertebral vascular anomalies are neoplasm,the clonility nature will be confirmed by analysing the X-chromosome inactivation status and the polymorphisms of AR by nested PCR; and Tie2 gene mutation is associated with vascular malformations,but which role and mechanism is not clear in vertebral vascular anomalies,so we will detect Tie2 mutation and Tie2 pathway related genes，proteins in vertebral vascular malformations by RT-PCR,and transfect wild type and mutant type Tie2 gene in vascular endothelial cells,observe the difference of above genes and proteins,the proliferation and apoptosis of cells,to explore the pathogenic role of Tie2 gene mutation in vertebral vascular anomalies. All the results of the above researches will be summerized to draw out a more reasonable clinical diagnosis and treatment scheme for vertebral vascular abnormality.

血管异常在椎体的发生率较高，通常被称为血管瘤，新近观点认为其绝大多数可能为血管畸形，我们的前期研究也表明GLUT-1,ki-67,VEGF蛋白在两者中的表达具有明显差异，由于不正确的命名往往导致治疗上的混乱，故明确椎体血管异常为血管肿瘤亦或血管畸形及其发病机制对选择合理的治疗方案具有重要意义。本课题基于X染色体失活的嵌合性和X连锁雄激素受体基因的多态性，运用巢式PCR技术，明确椎体血管异常为单克隆性的血管肿瘤亦或多克隆性的血管畸形；Tie2基因突变与血管畸形发生关系密切，但在椎体血管异常中的作用及机制尚未明确，故本课题用RT-PCR等方法对椎体血管畸形及真性血管肿瘤进行Tie2突变及其通路相关基因及蛋白检测，并细胞转染野生型及突变型Tie2基因，观察上述指标及细胞增殖和凋亡的变化，探讨Tie2基因突变在椎体血管异常致病过程中的作用，为椎体血管异常的正确诊断和治疗策略的研究提供理论依据。

目的：（1）明确椎体血管异常的病变单克隆性的血管肿瘤亦或多克隆性的血管畸形。（2）探讨椎体血管瘤和血管畸形的免疫组织化学特征，为难以鉴别的椎体血管异常提供免疫组织化学依据。（3）探讨Tie2基因突变在椎体血管畸形发病中的作用及机制。方法：（1）用PCR方法，对血管异常进行克隆性分析。（2）用免疫组化的方法，比较血管瘤和血管畸形相关蛋白表达的差异。（3）检测Tie2基因突变点，探索椎体血管畸形与Tie2基因突变的关系。（4）运用RT-PCR方法检测血管异常Tie2通路相关基因mRNA。（5）对Cos-7血管内皮细胞株进行转染，用Western Blot方法检测Tie2通路相关蛋白。用RT-PCR的方法检测血管内皮细胞株中Tie2通路相关基因的mRNA。用流式细胞仪检测细胞增殖周期及凋亡。结果：（1）经克隆性分析结果显示，椎体及软组织血管畸形AR基因酶切后扩增出两条带；增殖期血管瘤AR基因经酶切后两条带中一条带明显减弱或消失。（2）GLUT1、Ki-67、VEGF、bFGF、uPA、MMP2、PI3K和Akt蛋白在增殖期血管瘤中的表达均显著高于血管畸形（P均＜0.05）；GLUT1、Ki-67和VEGF在椎体血管瘤中的表达均高于椎体血管畸形（P＜0.05）。（3）在60例软组织血管畸形中检测到了2种Tie2基因有意义突变，2690A＞G（Y897C）、2740C＞T（L914F），2种无意义突变，2763G＞A、2688C＞T；并且我们首次在椎体血管畸形中检测到了Tie2基因突变2743C＞T（R915C）。（4）Tie2、Ang1和Ang2 mRNA在血管畸形中的表达水平显著低于血管瘤（P＜0.01）；在血管畸形中突变型Tie2 mRNA的表达水平显著高于野生型（P＜0.05）。（5）在Cos-7血管内皮细胞株中，Tie2基因野生型及突变型对Tie2通路蛋白表达的影响未见明显差异；Tie2基因突变可上调Ang2基因mRNA的表达；Tie2基因突变能降低凋亡细胞的比例。结论：（1）绝大多数椎体血管异常为多克隆性的血管畸形，而非真性肿瘤。（2）蛋白可能有助于椎体血管瘤和血管畸形的鉴别。（3）血管瘤和血管畸形可能为基因学改变不同的两种病变。（4）椎体及软组织血管畸形可能为不同部位的同种病变。（5）Tie2基因突变可能促进血管病变进展。