新生隐球菌减数分裂特异性基因ISC10的生理功能研究

课题组已结题的课题采用基因芯片筛选巨噬细胞吞噬前后新生隐球菌基因表达的mRNA差异，发现新生隐球菌出芽率下降与ISC10基因表达下降有关，ISC10因子可能为与孢子减数分裂和孢子形成有关的毒性因子。前期工作已克隆了ISC10基因并明确了其序列，本课题将通过对ISC10基因在新生隐球菌细胞中的位置及其动态变化、ISC10基因对毒力和菌体在宿主细胞内命运的影响以及ISC10对酵母自身其他基因表达的影响的研究，明确ISC10编码产物的性质，了解该基因在体外培养菌体中的表达动态，尤其是明确与细胞周期中减数分裂的定量关系，比较缺失ISC10的酵母与野生型是否存在胞内存活能力的差异。如果存在差异，将进一步明确这种差异对新生隐球菌的毒力有无影响，这种影响是否关系到新生隐球菌存活或者是否毒力的关键。利用免疫亲和沉淀通过蛋白质质谱分析构建ISC10基因相互作用的初步网络。

本课题旨在发现减数分裂相关基因的生理功能及在其隐球菌侵染宿主时所发生的毒性作用。.利用农杆菌Ti质粒介导，转化和构建了突变菌株库。经与酿酒酵母纺锤体关卡相关下调基因比对，证实所获得的突变株确为减数分裂突变菌株。根据某一代谢途径中表达改变基因的数量多少，对表达发生改变基因较多的几条途径进行了较深入的分析及对菌株全局性表达的影响和调控结构：纺锤体关卡相关下调基因为：mad2,bub1,APC/C,cdc20；减数分裂前复制期相关下调的基因为：cdc45, MCM,dbf4, cdc28；与细胞周期相关的基因绝大多数下调，只有grr1,swi5显著上调，突变菌株中同属该复合体的其他几个基因，如swi4,swi6,snf1的表达则显著下调；与减数分裂相关性比较大的肌醇磷酸途径的基因转录改变则不是太明显；分支氨基酸和酪氨酸代谢途径的许多基因的表达则明显升高（这是本研究中非常意外的发现，在用tyrosine metabolism和meiosis检索，没有检索到任何酪氨酸代谢和减数分裂相关的论文。对于这个问题的深入研究已申请下一个自然基金。） .对表达发生改变基因较多的几条途径进行了较深入的分析，发现Ime2基因对减数分裂影响最大。Ime2在从酿酒酵母到哺乳动物等真核生物中广泛存在，是一丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中首先被发现成员，在新生隐球菌中 ime2 功能研究几乎为零。我们的研究发现在新生隐球菌的细胞生长过程中， ime2在功能上与Cdc28相关，对细胞的生长周期和减数分裂都至关重要，尤其在酵母出芽的过程中，Ime2蛋白的一种减数分裂特异性碱性蛋白酶，它的活性靶标是细胞内的单链DNA结合蛋白复制蛋白A（replication protein A, RPA)，该蛋白在DNA复制、修复和重组中起关色键作用。因此ime2通过多个代谢过程参与了减数分裂调控 。.为了确定新生隐球菌 ime2 是否具有减数分裂以外的功能，以及其中可能的机理，我们比较了野生型和C. neoformans ime2 在 YPD培养基上的转录组。数据显示一系列先前未报道的基因的转录受其调控。这些基因调控的途径可能是ime2非减数分裂调控功能的体现。这些受影响的基因包括隐球菌甾醇合成、细胞壁结构、物质运输、蛋白质合成和修饰过程相关基因。