反义mRNA介导的贾第虫表面抗原变异后转录调控机制的研究

The variation of surface antigen is one of the major strategies that Giardia parasite to evade host immune attach. Further understanding the mechanism underlying the regulation of variant surface protein (VSP) during Gardia’s life cycle and parasitism would be very important for the control of the infection and treatment of giardiasis. In our previous study we have established the methods to identify the sense and anti-sense mRNAs for VSPs by PCR, the transcription of the anti-sense mRNA of VSPs and their possible post-transcriptional gene silencing (PTGS) effects on the regulation of VSP expression. In this proposal, we would like to target VSP16, one of the VSPs we identified in our previous study, as a model to further understand the mechanism behind the regulation of VSP. Through the expression of VSP16 recombinant protein, making the monoclonal antibody against VSP16, the variation of VSP16 expression will be monitored using immunofluorescence assay. At the same time, the transcription of VSP16 mRNA, sense and anti-sense mRNA of VSP16 will be investigated and the relationship between the expression of VSP16 on the surface of Giardia and the level of anti-sense mRNA will be analyzed. In order to understand the effects of RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) and Dicer on the post-translational regulation of anti-sense VSP16 mRNA, the Duplex-specific nuclease (DSN) will be used to make miRNA to knock-out these two enzymes to identify their function on the regulation of VSP variant expression of Giardia. The understanding of the mechanism for the regulation of VSP expression will provide a pivot approach for the control of giardiasis that affect millions people in the world.

表面抗原（VSP）变异是贾第虫等寄生生物逃避宿主免疫应答的主要策略，其机制研究对于阐明抗原变异的生物学功能和有效预防策略,具有重要意义。申请人前期工作已建立PCR为基础的特异性VSPs编码正义和反义mRNA的扩增技术，报道了贾第虫VSPs反义mRNA的转录，及在贾第虫VSPs表达后转录调控（PTGS）的作用。在此基础之上，本课题拟以VSP16单克隆贾第虫虫株作为研究对象，采用单克隆抗体免疫荧光技术（IFA）对VSP的变异进行监测；并通过对核初始mRNA转录分析及转录后胞浆反义mRNA的检测，阐明反义mRNA转录是VSPs变异的的重要环节；同时应用基因敲除技术，研究在VSPs转换过程中，RdRp对反义mRNA转录作用，及 Dicer对双链mRNA的切割作用，阐明以反义mRNA介导的贾第虫VSPs变异PTGS机制,为揭示VSPs变异机制以及生物体内反义mRNA的转录现象奠定生物学基础。

蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）是引起腹泻的病原体之一，是重要的模式生物。贾第虫表面抗原，即变异特异性表面蛋白 （variant-specific surface proteins,VSPs）的变异与其致病密切相关，是贾第虫逃避宿主免疫应答的主要策略。贾第虫 VSP 变异机制的研究对于揭示抗原变异的生物学功能具有重要意义。课题组根据贾第虫 VSPs mRNA 的分子特点，即 C-端保守的 CRGKA 基序，设计合成 VSPs 特异性简并引物，通过引物组合的方法，建立了以 PCR 为基础的特异性 VSPs 编码正义和反义 mRNA 的扩增技术。应用该技术，以贾第虫的总 RNA 为模板，分别对贾第虫 VSP 的正义 mRNA 和反义 mRNA 进行特异性扩增，结果共获得 34 个来源于贾第虫C2 株的 VSPs 编码序列，其中 5 个来源于正义 mRNA，29 个来源于反义 mRNA，证实了贾第虫VSPs 正义 mRNA 和反义 mRNA 是同时存在的，且在 VSPs 正义 mRNA 特异性扩增过程中，得到大量的 RNA 降解产物。表明反义 mRNA 参与的调控主要发生于转录后。当虫体内出现多个 vsp 转录时， 在 RpRd 的催化下产生特异性反义 mRNAs； 正义 mRNA 与反义 mRNA 互补形成 dsRNA 后被降解。 其中只有特异性表达的 VSP 可以避开沉默机制 （不产生反义 RNA） 而被表达于贾第虫的细胞表面。采用染色质组学的方法发现，相对于滋养体，成囊期的虫体VSP蛋白显著上调，说明在贾第虫成囊的过程中VSP大量甚至过量表达。从成囊启动到形成成熟包囊需要一定的时期，表面抗原的变化对于贾第虫逃避宿主的免疫反应非常有利，有利于提高虫体的生存力，从而提高成囊率。贾第虫成囊过程中的表面抗原变异，对于揭示虫体的变异规律具有重要意义，有待进一步深入研究。