电驱动希瓦氏菌固碳的NADH再生机制和调控研究

Carbon dioxide biological fixation is the most basic metabolic process to synthesize complex organic compounds and is the best way to utilize greenhouse gas as a sustainable feedstock. Co-enzyme NADH regeneration shows an essential role for providing reducing power to carbon sequestration in microbiology. Using electricity to drive intracellular NADH regeneration is a highly efficient and low-cost technology to provide sufficient reducing co-enzymes. However, the mechanism of electro-driven NADH regeneration is not clear and it is difficult to regulate that process effectively. We have previously constructed recombinant electroactive bacteria of Shewanella oneidensis, which was capable to convert CO2 into acetic acid under electro-driven conditions. . Based on these preliminary results, we will systematically investigate the rules of electro-driven carbon fixation of Shewanella oneidensis and determine the importance of NADH regeneration for carbon fixation. Afterwards, we will identify various reverse electron transfer pathways involved in NADH regeneration by a series of analysis methods, including global transcriptomic analysis, gene regulation analysis and pathway reconstruction in heterologous host like Escherichia coli. Based on exploring relationships between various reverse electron transfer pathways, a multi-pathway network model for reverse electron transfer and electro-driven NADH regeneration will be proposed and validated. On the basis of the model of reverse electron transfer network, the artificial regulation strategy of electro-driven NADH regeneration will be explored. According to that strategy, the regenerating rate and consuming rate of NADH can be balanced to greatly improve the CO2 fixation ability of Shewanella oneidensis. . This project will provide new insight into the electron transfer mechanism of electro-driven intracellular NADH regeneration in microorganisms, develop an artificial regulation method to control electro-driven intracellular NADH regeneration. These new knowledge and methods to be delivered will add new dimension to utilize CO2 as sustainable feedstock resource.

生物固碳是生物合成复杂有机物的最基本代谢过程，也是温室气体资源化利用的最佳方式之一。NADH是微生物固碳的重要还原力，通过电来驱动胞内NAD+还原是一种高效率、低成本的辅酶再生新技术。但电驱动微生物NADH再生机制不清晰，难以有效人工调控。我们前期获得了可在电驱动条件下固定CO2的重组希瓦氏菌。据此，本项目将系统考察电驱动条件对希瓦氏菌固碳的影响规律，阐明电驱动NADH再生对生物固碳的作用；采用组学分析、基因调控分析和途径异源重构分析，确定参与NADH再生的多种反向电子传递途径；解析各途径之间的关系，提出并验证电驱动NADH再生过程中的反向电子传递网络模型；在此基础上，探索电驱动胞内NADH再生的人工调控策略，平衡NADH再生与消耗速率，实现希瓦氏菌的高效固碳。该研究将有助于揭示电驱动胞内辅酶再生的电子传递机制，创建电驱动辅酶再生的人工调控方法，为推进CO2资源化利用提供新理论、新方法。

通过电能来驱动微生物还原CO2是一种新兴的生物固碳技术，采用该技术可以拓展微生物胞内生物还原力和能量再生的新模式，为构建高效的生物固碳体系提供一种重要的可行之路。然而，微生物如何摄取、转化胞外电能到胞内生物还原力的电子传递途径未知，导致目前难以设计高效的微生物电合成系统。本课题选取电活性模式菌为研究对象，研究了微生物在反向电子传递过程中与电极的作用规律、电子传递方式以及微生物代谢方式，解析了电子跨膜传递的主要途径；随后，通过蛋白工程技术理性设计了特异性吸附胞外电极的蛋白纳米纤维，再采用基因工程技术实现上述纤维在希瓦氏菌中的活性表达和表面自组装，构建了高效吸附不锈钢电极的电活性生物膜，实现了该重组菌高效利用电能来还原CO2的能力(库伦效率接近99%)；进一步，通过蛋白工程策略和基因重组技术，人工构建了能够还原CO2到甲烷的固氮酶突变体及其工程菌株，经过全细胞光催化性能分析、固氮酶蛋白结构分析和催化位点分析，揭示了固氮酶利用电子来催化还原CO2到甲烷的机制，最终通过体系优化，光驱动重组沼泽红假单胞菌还原CO2到甲烷的最高转化率可达35%，甲烷积累量最高为14.58 μmol/h/g total protein；为进一步提升电活性菌在还原CO2过程中的电子利用能力，本课题设计了生物相容的非生物-生物界面，即通过微生物自合成半导体纳米颗粒定向分布在细胞表面或周至空间，强化了电活性菌的胞外光激发电子的转移效率和CO2生物甲烷化效率；同时，针对用于电力/太阳能驱动CO2生物甲烷化的非生物-生物耦合系统进行了机理探究，并对耦合体系中的电化学和光化学CO2生物甲烷化反应进行了全面综述，提出了优秀的合成生物学策略，这有助于建立更高效的生物固碳杂合体系。本课题的开展将有助于深入解析微生物电合成系统中微生物电子传递机制，为理性设计效率更高、兼容性更好的电能转化利用生物固碳杂合体系提供新的策略和思路，为助力我国“双碳”目标添砖加瓦。