二仙汤协同自体骨髓间充质干细胞移植治疗卵巢早衰实验研究

卵巢早衰(POF)主要表现为过早绝经和提前出现围绝经期症状。近年因恶性肿瘤行化疗而导致POF和不孕者日渐增多，由此而造成的卵巢功能低下及生育力丧失已成为威胁妇女生殖和心理健康的重要因素。但以激素替代为主的治疗手段有限，效果不理想。本研究采用传统方剂二仙汤与自体骨髓间充质干细胞(MSCs)注射联合治疗化疗所致POF，并从以下方面探讨其治疗效果：建立化疗损伤性POF的大鼠模型，分离、纯化MSCs，标记后行进行卵巢移植注射，同时灌胃二仙汤，检测卵巢内移植MSCs的存活及分化状态；观察协同治疗后卵巢结构及功能的恢复情况，并测定卵巢组织的凋亡及凋亡相关蛋白；将卵巢颗粒细胞与MSCs 在体外共培养，并辅以二仙汤含药血清刺激，测定经化疗药物诱导后的凋亡、细胞因子及蛋白表达情况。从而探讨二仙汤可协同改善MSCs定向迁移微环境，提高归巢率，规避和降低MSCs异化风险的机制，为卵巢早衰治疗奠定基础。

卵巢早衰(POF)主要表现为过早绝经和提前出现围绝经期症状。近年因恶性肿瘤行化疗而导致POF和不孕者日渐增多，由此而造成的卵巢功能低下及生育力丧失已成为威胁妇女生殖和心理健康的重要因素。但以激素替代为主的治疗手段有限，效果不理想。本研究采用传统方剂二仙汤与骨髓间充质干细胞(MSCs)注射联合治疗化疗所致POF。原代BMSCs在接种24小时后贴壁生长，呈圆形，72小时后部分贴壁细胞形态为长梭形。第3代BMSCs表达CD29、CD90，而不表达CD34、CD45。当MOI为200时，EGFP标记率高，且对细胞形态及生长无明显影响，EGFP在转染24小时后开始表达，72小时后高表达。原代GCs在接种48小时后贴壁生长，呈圆形，细胞稀疏，传代后细胞呈集落样生长。第1代GCs表达FSHR，而多边形及梭形杂细胞表达阴性。当顺铂浓度为5mg/L和7.5mg/L时，颗粒细胞生长明显受抑制。BMSCs与GCs共培养后，GCs存活率升高，凋亡率降低。当GCs受顺铂损伤后，BMSCs向损伤的GCs迁移数明显多于向正常GCs迁移数。MSCs中HGF、IGF-1、VEGF的表达量显著高于GCs。Western-Blotting法检测发现与实验对照组相比，GCs中Bax表达无显著性差异，Bcl-2表达显著增加。透射电镜下观察可见各组GCs均出现不同程度的核皱缩、核碎裂及凋亡小体等细胞凋亡特征。与正常对照组比较，15％与20%浓度的二仙汤含药血清能促进骨髓间充质干细胞增值（P<0.05），促进细胞由G0/G1期进入S期及G2期。与正常血清比较，二仙汤含药血清促进骨髓间充质干细胞跨膜迁移(P<0.01)。BMSCs移植后，BMSCs主要分布在大鼠卵巢门和卵巢髓质中，在卵巢皮质有少量的BMSCs，且部分BMSCs围绕在卵泡周边，而在卵泡和黄体中没有BMSCs的分布。BMSCs移植30天后，在治疗组大鼠卵巢中，窦状卵泡和雌二醇水平明显高于POF模型组。在BMSCs治疗组大鼠卵巢中可见各级卵泡发育，并且有发育良好的窦状卵泡及黄体。二仙汤可协同改善MSCs定向迁移微环境，提高归巢率，规避和降低MSCs异化风险的机制，为卵巢早衰治疗奠定基础。