不同构象下DHPM改性β-乳球蛋白的体外模拟消化酶解稳态动力学与过敏性关系

β-lactoglobulin (β-Lg) is the main elicitor of milk allergies. Its antigenicity may be changed by treatments in the food production and the hydrolysis process in vitro digestion. In our previous work, it was observed that dynamic higy pressure microfludization (DHPM) induced the unfolding of β-Lg, contributing to the significant increase of its antigenicity; but its antigenicity obviously decreased after digestion treatment. However, it was still unkown the relationship bewteen tha hydrolysis process and the changes of antigenicity after the conformational changes of β-Lg. Thus, the β-Lg modified by DHPM was chosen as the investigated materials. Antigenicity changes of β-Lg were analyzed by Indirect ELISA and SDS-PAGE immunoblotting through simulating the enviroment in vitro digestion. The conformational changes was investigated during the hydrolysis process by molecular weight, SH contents, secondary structure and tertiary structure. The initial state of enzymatic process was investigated by the affinity of enzyme and substrate and the stability of substrate in the enzymatic conversion state. The enzymatic terminate state was characterized by hydrolysis ratio, hydrolysis site, amino acid sequence, and peptid analysis. Then, the diverseness of enzymatic hydrolysis reaction course in the different conformational β-Lg was compared; the model of the relationship among the changes induced by the different factors was established; and the relationship bewteen the enzymic hydrolysis steady-state kinetics and the antigenicity changes was revealed. These studies can provide the theoretical principle for the allergic mechanism and immunological studies of β-Lg.

β-乳球蛋白（β-Lg）是牛乳及其制品中主要的过敏源之一，食品加工手段及体内消化酶解过程都可能改变其过敏性。前期研究发现动态高压微射流（DHPM）改性β-Lg的构象发生去折叠化导致过敏性增加，但经体外模拟消化酶解后过敏性却显著降低，然而关于构象变化促使其消化酶解过程变化与过敏性的关系有待进一步深入研究。本项目拟以DHPM改性β-Lg为对象，模拟体内消化酶解环境，分析酶解前后β-Lg的过敏性（间接竞争ELISA和SDS-PAGE免疫印迹法）；表征酶解过程空间构象（分子量、巯基含量和二三级结构）的变化；利用酶与底物的亲和力和底物稳定性等方法研究酶解初始态；通过表征酶解率、酶切位点、氨基酸序列和肽段分析酶解终止态；比较不同空间构象β-Lg酶解过程的差异性，建立各因素变化关系的稳态动力学模型，揭示不同构象下的酶解稳态动力学与过敏性变化之间的关系，为β-乳球蛋白过敏机制和免疫学基础研究提供理论参考。

β-乳球蛋白（β-Lg）是牛乳及其制品中主要的过敏源之一，通过食品加工手段改变其过敏性是科学领域关注的热点研究问题。关于动态高压微射流（DHPM）改性β-Lg体外消化酶解历程与过敏性的关系有待深入探讨。本项目通过研究原料β-Lg经过DHPM不同压力改性得到不同构象下的β-Lg，在不同的体外消化酶解条件下探讨其构象变化。结果表明，采用胃蛋白酶酶解DHPM改性β-Lg时，β-Lg构象变化与胃蛋白酶作用时间存在密切关联，当压力由0.1 MPa增加至80 MPa时，DHPM协同胃蛋白酶处理能显著提高β-Lg的-SH含量，而蛋白质的表面疏水性减弱，二级结构以及氨基酸三维空间构象暴露程度发生一定的变化且同一压力下随着胃蛋白酶酶解时间的延长，β-Lg构象的变化更加显著。这些变化说明DHPM作用下促进了β-Lg和胃蛋白酶的相互作用，导致蛋白质构象发生了显著变化；此外，我们比较了不同酶解阶段DHPM改性β-Lg的构象和过敏性变化，相较于模拟胃消化，体外模拟胃肠道消化过程DHPM改性β-Lg的构象发生更大程度的变化，导致其过敏性降低更为显著；在此基础上，我们系统了研究不同构象下β-Lg体外消化前后结构与过敏性的关系，研究发现DHPM改性β-Lg在体外模拟消化后过敏性随着DHPM改性压力增加而降低；通过SDS-PAGE、动静态光散射、电镜扫描、圆二色谱、液质等设备研究其在消化过程的构象变化，结果表明与未处理样品比较而言，DHPM改性β-Lg在体外消化过程产生更多的小分子及小颗粒物质，且其二三级结构也发生了明显的变化，与其致敏性降低存在一定的相关性。基于以上研究本项目继续开展DHPM改性β-Lg酶解稳态动力学与其过敏性关系研究。根据稳态动力学分析得知，随着压力的升高，β-Lg的消化吸收能力的提高伴随着其在消化过程过敏性的显著降低。这些主要是通过kc的增加、Km的降低、总催化效率（kc/Km）的增加以及结合容量的增加反映出来的。研究结果表明尽管动态高压微射流技术低压段处理过程中能提高β-Lg的过敏性，但同时也能提高β-Lg的消化吸收能力导致蛋白质在消化过程其过敏性显著降低。本项目为解释β-Lg过敏性变化机制提供理论参考。