增免抑瘤复方含药血清对卵巢癌干细胞微环境及信号转导途径影响的体外试验

卵巢癌干细胞的存在是卵巢癌复发转移及化疗耐药的根源，其生存与激活依赖于局部缺氧微环境及其相互之间的信号转导，涉及缺氧诱导因子HIFS为关键基因介导的oct-4等转录因子及notch为主的多种信号转导途径，刺激卵巢癌干细胞增殖分化及血管新生。因此以微环境及信号通路为靶点成为卵巢癌治疗新策略。本课题组既往研究证实增免抑瘤复方能减少卵巢癌复发转移，改善化疗耐药，其机制与下调HIF-1及VEGF表达，抑制血管新生、促进细胞凋亡有关。为了进一步阐明增免抑瘤复方是否通过益气养阴、清热解毒改善肿瘤局部缺氧及信号转导，从而抑制卵巢癌干细胞的增殖与分化？本课题以人卵巢癌细胞株分离卵巢癌干细胞，在常氧/低氧环境下诱导，并以中药含药血清体外干预，从改善缺氧以及抑制血管新生等相关信号途径探讨增免抑瘤复方的抗卵巢癌作用机制。

卵巢癌在治疗中，卵巢癌耐药是治疗中的最难克服的难题。随着卵巢癌干细胞研究的深入，发现卵巢癌耐药与卵巢癌干细胞密切相关。因此本研究通过无血清培养基悬浮培养法富集卵巢癌干细胞,由于卵巢癌干细胞无血清培养的特殊环境，故本研究由增免抑瘤含药血清更改为通过对增免抑瘤复方有效单体进行筛选，确定最优单体在常氧及缺氧条件下对卵巢癌干细胞微环境及信号转导的影响，报批国家自然基金委员会获得批准。本研究通过对有效单体汉黄芩素、芹菜素、木犀草素、黄芩素、熊果酸、齐墩果酸进行筛选，发现常氧条件下，熊果酸对于卵巢癌干细胞的增殖抑制效果明显，并且熊果酸联合顺铂作用明显优于顺铂单用组，确定熊果酸为ZMYL复方最佳单体。于缺氧条件下培养卵巢癌干细胞后，发现伴随着HIF-1α的升高，其对顺铂的耐药性明显升高，并且耐药指标ABCG2也出现了明显的升高。当给予HIF-1α抑制剂YC-1后，HIF-1α与ABCG2的表达皆出现下降，当YC-1联合熊果酸使用，这种抑制更为明显。为进一步研究HIF-1α与耐药指标ABCG2的关系，通过RNA干扰技术将HIF-1α沉默后，可以发现其耐药指标ABCG2出现明显降低，说明缺氧条件下卵巢癌干细胞的耐药与HIF-1α相关。通过shRNA HIF-1α及PI3K抑制剂LY294002发现HIF-1α通过PI3K/AKT通过调节ABCG2的表达，熊果酸可以明显抑制PI3K/AKT信号通路上的关键蛋白p-PI3K、p-AKT-T308、p-AKT-s492，熊果酸可以经PI3K/AKT通路通过下调HIF-1α抑制耐药指标ABCG2的表达，从而达到在缺氧环境下逆转卵巢癌耐药的作用。