猪乳N-链寡糖对仔猪肠道菌群的调控作用及机理研究

Porcine milk is rich in nutrients and is of great importance to the growth and development of piglets. Previous studies showed that porcine milk N- glycan has a positive effect on the intestinal microflora of piglets. In order to eliminate the interference of free oligosaccharide in porcine milk, this project will release the N-glycan by using PNGase F and purify it. The effects of porcine milk N-glycan on intestinal flora of piglets will be investigated by in vitro fermentation. The structure of N- glycan, free monosaccharide and organic acids will be determined by HPLC and so on. On this basis, we will explore the following mechanisms. The effect of porcine milk N- glycan on the growth characteristics of probiotics / harmful bacteria such as Lactobacillus and swine pathogenic Escherichia coli. The inhibition of N- glycan on E. coli. The effect of porcine milk N- glycan on the barrier function of intestinal epithelial cells. Finally, try to find out what are the major functional components by the treatments of human milk N-glycans with a variety of exoglycosidases. The success of this project will provide the explanation that how porcine milk N-glycan regulates intestinal flora in piglets.

猪乳含有丰富的营养物质，对仔猪正常的生长发育具有重要意义。前期研究结果发现猪乳中的N-链寡糖对仔猪肠道菌群结构存在一定积极影响。为排除猪乳中游离寡糖的干扰，本项目将用N-糖酰胺酶把猪乳N-链寡糖从猪乳蛋白上释放下来，并进行纯化。采用体外发酵、PCR和16S rRNA基因序列分析方法，研究猪乳N-链寡糖对仔猪肠道菌群的影响，用HPLC等测定体外发酵后N-链寡糖结构、单糖组分和有机酸等代谢产物。在此基础上，从以下几个方面探索其作用机制：猪乳N-链寡糖对纯培养的乳酸杆菌和猪源致病性大肠杆菌等益生菌/有害菌生长特性的影响；采用细胞模型，研究猪乳N-链寡糖对致病性大肠杆菌的粘附抑制率；采用细胞模型，研究猪乳N-链寡糖对猪小肠上皮细胞屏障功能和细胞因子的影响。最后，采用多种外切糖苷酶处理猪乳N-链寡糖，筛选并鉴定出相应的主效因子。本项目的成功实施将阐明猪乳N-链寡糖如何调控仔猪肠道微生物提供理论依据。

猪乳含有丰富的营养物质，其中就包括乳蛋白上的N-链寡糖，对仔猪正常的生长发育具有重要意义。为进一步研究猪乳中的N-链寡糖对仔猪肠道菌群结构的影响，本项目从以下几个方面进行了相关探索。由于N-链寡糖具有量少，又不容易分离检测的特点，本项目首先分析比较了多种糖衍生试剂，为后续乳N-链寡糖的提取分离和活性分析奠定了基础。接着，分析比较了三氯乙酸沉淀法和氯仿/甲醇有机溶剂沉淀法获取猪乳和牛乳蛋白，再通过酶法提取猪乳和牛乳N-链寡糖，最后依次用C18固相萃取柱和石墨炭固相萃取柱获得纯化的乳N-链寡糖。最后，通过抑菌圈法和测定生长曲线法，比较了猪乳N-链寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌四种致病菌的抑制效果，并和牛乳N-链寡糖进行比较。结果表明，猪乳N-链寡糖对四种致病菌均有不同程度的抑制作用，并且猪乳N-链寡糖对四种致病菌抑制作用比牛乳N-链寡糖的抑制作用好。后续本课题将在前期建立的肠道菌群的体外培养模式基础上，进一步验证猪乳N-链寡糖对仔猪肠道菌群的影响。