Sopolamine 通过 mAchRs-AMPK 信号通路诱导自噬的机制研究

Muscarinic acetylcholine receptors, or mAChRs are members of the GPCR family. It has been reported that GPCRs regulate autophagy,but whether the mAchRs are involved in the regulation of autophay remain to be studied.The preliminary work of applicant showed that the antagonist of mAChRs,scopolamine induced autophagy. scopolamine induced autophagy levels decreased, After interference AMPK expression by the method of shRNA,which confirmed that scopolamine induced autophagy through AMPK signaling pathway. Based on the above foundings, we presume that mAChR - AMPK signaling pathway plays an important role in scopolamine induced autophagy. In order to verify this hypothesis, we plan to investigate the molecular mechanism of how mAchRs-AMPK cell signal regulates autophagy in NRK and A549 by the methods of shRNA to stablely knockdown gene mAchRs, QRT-PCR to test the efficiency of knockingdown, immunofluorescence and western blot to validation the affection of autophagy. All of these works are expected to clarify the molecular mechanism of how scopolamine induces autophagy and reveals the a new mechanism of autophagy.Our study will provide new insights for the autophagy regulation mediated by mAchRs and AMPK.

毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAchRs）是G蛋白偶联受体(GPCRs) 家族中一员。研究表明GPCRs调节自噬，但mAchRs是否参与自噬的调控有待研究。申请者在前期工作中发现mAChRs的拮抗剂东莨菪碱 (scopolamine) 诱导自噬。shRNA干扰AMPK 表达后，scopolamine诱导的自噬水平减弱，证实scopolamine 通过AMPK信号通路诱导自噬。基于以上研究基础我们推测：mAChR–AMPK信号通路在scopolamine诱导的自噬中发挥重要作用。本课题拟以NRK和A549细胞为研究对象，采用shRNA稳定敲低 mAchRs等基因，QRT-PCR检测敲低效率，细胞免疫荧光和蛋白质印迹验证对自噬的影响，研究 mAchRs-AMPK调节自噬的分子机制。本课题将明确mAchRs和AMPK在自噬调节作用中的内在联系，为了解自噬的作用机制提供一些帮助。

东莨菪碱 (scopolamine)，一种莨菪烷类生物碱的化学小分子，用于治疗术后呕吐，焦虑症，并可作为迷幻剂使用。我们的研究表明scopolamine 诱导自噬。shRNA干扰AMPK表达后，scopolamine 诱导的自噬水平减弱，证实 scopolamine 通过AMPK信号通路诱导自噬。东莨菪碱不影响p62蛋白的表达，但能使Drp1蛋白含量上升，mitofusion1 蛋白含量下降，活细胞和透射电镜结果表明，东莨菪碱能破坏线粒体。我们结果提示东莨菪碱可能使线粒体受损并激活AMPK信号通路与线粒体自噬。糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的全球性慢性代谢性疾病。糖尿病患者临床的主要表现为胰岛β细胞衰竭导致的胰岛素缺乏和机体对胰岛素缺乏正常反应的胰岛素抵抗。Ⅰ 型糖尿病（T1DM）和 Ⅱ 型糖尿病（T2DM）均表现为进行性胰岛β细胞衰竭。凋亡是两种糖尿病患者胰岛β细胞死亡的主要形式。高血糖是糖尿病患者最显著的特征，糖尿病模型证实葡萄糖毒性是胰岛素抵抗、胰岛素分泌受损和胰腺β细胞衰竭的一个重要因素，同时，慢性低度炎症促进了免疫炎症代谢与胰岛素抵抗以及β细胞功能障碍。武靴藤中的活性物质 Gymnemic acid I（GA I），传统中药复方消渴平（XKP）和大蒜中的有机硫化合物具有抗糖尿病作用，但分子机制有待阐明。我们的结果表明，高浓度的葡萄糖可促进细胞凋亡，而在高浓度葡萄糖胁迫下，GA I和XKP可降低细胞凋亡。我们进一步的研究发现，在正常或高浓度葡萄糖胁迫下，通过细胞免疫荧光和免疫印迹法证实，GA I，中药复方消渴平和大蒜的有机硫化合物可增加细胞的自噬体数目和 LC3-I/LC3-II 的比值，并抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白s6激酶β-1（p70 s6k/s6k1）的磷酸化。在高浓度葡萄糖胁迫下，GA I，XKP 和大蒜中的有机硫化合物降低了细胞凋亡率和 caspase 3 活性。自噬抑制剂 3-MA 对小鼠细胞的凋亡率和 caspase 3活性抑制作用明显增强。我们的数据表明，GA I，中药复方消渴平和大蒜的有机硫化合物诱导的自噬通过抑制mTOR的磷酸化活性以保护胰岛β细胞和巨噬细胞。