酸敏感离子通道在骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘中的作用机制研究

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is a promising therapy for degenerated intervertebral disc through differentiation, nutrition and immunoregulation. However, reduced cell viability and proliferation of BMSCs in acidic intervertebral disc will result in the low repair efficiency. Acid-sensitive ion channels (ASICs) are usually considered as key receptors for extracellular protons, and playing a important role in acidosis-mediated pathological process. Previous studies have showed that functional ASIC1a, ASIC3 were expressed on the membrane of BMSCs. ASIC1a channels activated by H+ exhibits a high Ca2+ permeability, which results in Ca2+ overload followed by cell necrosis, apoptosis or autophagy. It is known that activated ASIC3 improves the anti-apoptosis ability and reduce cell death in acidosis. Whether ASICs can play a role in the survival of BMSCs when transplanted in intervertebral disc? The present study attempts to, examine the influence of ASIC1a and ASIC3 on intracellular Ca2+ concentration, cell viability and proliferation of BMSCs in acidosis, the injury mechanism of ASIC1a and protect mechanism of ASIC3 and observation of the repair effects of BMSCs with ASIC1a knockdown and ASIC3 over-expression on intervertebral disc. The purpose of this study is to clarify the role of ASICs on the outcome of BMSCs when transplanted in intervertebral disc, which may promote the clinic application of BMSCs therapy.

骨髓间充质干细胞（BMSCs）通过分化、营养及免疫调节等作用修复椎间盘退变。但椎间盘酸性环境限制了BMSCs的生存能力和修复效率。酸敏感性离子通道（ASICs）是组织酸化损伤的关键靶点，在BMSCs胞膜上表达ASIC1a和ASIC3两种亚型。已知，ASIC1a被激活后介导细胞内Ca2+超载而引起多种细胞死亡，ASIC3却能提高细胞的抗酸能力。本课题研究：1、在模拟椎间盘酸性环境下，ASIC1a和ASIC3的激活与BMSCs转归的相关性；2、在椎间盘酸性环境下，ASIC1a和ASIC3的激活与BMSCs修复作用关系；3、ASIC1a和ASIC3的激活对BMSCs转归和修复作用的调控机制；4、在动物模型中，干预ASIC1a和ASIC3基因的表达对BMSCs修复能力的影响。初步阐明BMSCs在椎间盘酸性环境中的转归及机制，并找出提高BMSCs的修复效率的新策略。

骨髓间充质干细胞（BMSC）移植等生物学手段已在动物模型中证实修复早期椎间盘退变的可行性，但同时发现在严重退变椎间盘恶劣微环境中，外源性干细胞生存能力有限，修复效率低下。椎间盘是一个缺血缺氧、酸性、高渗的环境，其中酸性环境在降低细胞活性和生理功能方面发挥着核心作用，并且随着椎间盘退变而加重。已有研究发现，在酸性环境下，神经、软骨等组织中细胞的活力、增殖能力及多种因子的合成能力明显下降，并且可能与细胞中酸敏感离子通道1a（ASIC1a）的激活有关。而明确BMSC移植过程中ASIC1a的生物学作用及其机制将有助于深入椎间盘酸性微环境中ASIC1a对BMSC的影响，为椎间盘退变的生物学治疗提供有效的干预靶点。本课题假设椎间盘酸性微环境通过ASIC1a影响BMSC的活力及修复效率，我们发现：.（1）通过体内BMSC移植治疗兔椎间盘退变，运用影像学、组织病理学及分子生物学等手段探明BMSC对退变椎间盘具有一定的修复作用。但椎间盘高度依然呈进行性降低，细胞外基质的表达也明显比正常水平低，因此，BMSC移植能在一定程度上修复椎间盘退变，但是修复效率有待提高。.（2）体外分离培养大鼠BMSC和髓核细胞（NPC），采用 Real time RT-PCR、 Western blot、免疫组织化学染色检测大鼠BMSC和髓核组织中ASIC1a的表达，证实大鼠髓核组织和BMSC均表达ASIC1a，且在退变髓核中，ASIC1a的表达明显增加。退变NPC可能通过旁分泌作用影响BMSC的 ASIC1a表达量，使其表达量增加。.（3）通过酸刺激模拟椎间盘酸性环境并阻断ASIC1a通路，运用相关分子生物学检测及电镜观察，发现在酸性环境中，BMSC表面ASIC1a被激活，引起细胞膜对Ca2+通透性显著增加，大量Ca2+内流，导致细胞因钙超载而损伤，用特异性的ASIC1a通道阻断剂PcTX1作用后，细胞存活率增加。提示 ASIC1a 可能是 BMSC 酸性应激损伤的靶点之一。.（4）构建siRNA干扰ASIC1a的NPCs，采用分子生物学方法评价ASIC1a活化对NPCs增殖凋亡的影响以及内质网应激指标表达变化情况。证实ASIC1a活化可以通过内质网应激相关特异性信号机制调控NPCs在酸性环境中的生物学活性。