基于高通量测序的低温胁迫下黄花苜蓿根部应答调控机制研究

Low temperature stress, one of the abiotic stresses that limiting crop growth and production, plays a key role on alfalfa winter-survival rate and yield in northern areas of China. Medicago falcate, an important forage in frigid zone, has a strong ability on low temperature resistance. It also is the most important gene sources and parent materials in alfalfa breeding. High-throughput sequencing technology (RNA-seq), the foundation of gene function research, can quickly and fully reveal the molecular mechanism of specific biological processes in any species. This project is to use wild M. falcate as materials. Through the use of physiological determination and RNA-seq technology, the physiological and transcriptome changes of M. falcate under low temperature stress will be assayed. After the differently expressed genes selection and the qRT-PCR of interest genes, the relationship between the physiological changes and transcriptome changes will be discussed. Finally, the response regulation mechanism of M. falcate root under low temperature stress will be clarified. The results obtained from this project will have important theoretical and practical significances on the molecular level research of M. falcate low temperature stress resistance regulation research. It not only provides abundant gene resources for breeding new alfalfa varieties with low temperature resistance, but also provides a new thinking for the development and utilization of alfalfa germplasms in China.

低温胁迫是限制作物生长与生产的主要非生物逆境之一，严重影响北方地区苜蓿的越冬率和产量。黄花苜蓿作为重要的寒带牧草，抗低温能力强，是苜蓿育种最重要的基因源和亲本材料。高通量测序技术（RNA-seq）是研究基因功能的基础和出发点，能够快速全面揭示生物参与特定生物学过程的分子机理。本项目以野生黄花苜蓿为材料，结合生理生化指标测定技术与RNA-seq技术，分析低温胁迫下黄花苜蓿根部生理生化变化和转录组变化，通过差异表达基因筛选和目的基因qRT-PCR定量，探寻生理生化指标变化与转录组变化之间的对应关系，最终阐明低温胁迫下黄花苜蓿根部应答调控机制。本项目的实施，将对分子水平上黄花苜蓿抗低温调控研究具有重要的理论指导和实践意义，既可为苜蓿抗低温新品种培育提供丰富基因资源，也可为我国苜蓿资源的开发利用提供新的研究思路。

低温胁迫是限制作物生长与生产的主要非生物逆境之一，严重影响北方地区苜蓿的越冬和生产。黄花苜蓿作为重要的寒带牧草，抗低温能力强，是苜蓿育种最重要的基因资源。本研究通过分析低温胁迫下根部生理生化指标变化和转录组变化，阐明了低温胁迫下黄花苜蓿根部应答调控机制。主要结论如下：. （1）低温胁迫下黄花苜蓿根部电解质外渗率和超氧阴离子含量上升、MDA含量随温度降低和处理时将延长呈先增加后降低趋势，表明低温胁迫损伤黄花苜蓿根部植物细胞、加剧细胞膜的膜脂过氧化，并产生活性氧毒害。同时黄花苜蓿根部SOD、POD、CAT、GSH等抗氧化酶活性和非酶抗氧化含量随超氧阴离子含量变化而变，对植物进行活性氧调节。此外，低温胁迫下黄花苜蓿根部可溶性糖和脯氨酸含量上升，以维持细胞渗透压，增强植物的渗透调节能力。. （2）低温胁迫下黄花苜蓿根部木质部中的木质素随着低温胁迫温度的降低和时间的延长而逐渐增做，形成层外围的木质素随处理温度的降低和处理时间的延长而逐渐减少，韧皮部随处理温度降低和处理时间的延长先颜色加深后变浅，表明木质素对黄花苜蓿的低温适应有积极作用，韧皮部积累的物质在黄花苜蓿低温适应的过程中被逐渐消耗。. （3）项目通过Illumina RNA-seq测序和Pacbio三代全长转录组测序研究了低温胁迫下黄花苜蓿根部转录组变化，共得到115,153条全长转录本序列，预测出8,849个可变剪切事件、73,149 个SSR、76,015个完整CDS区及4,189 个LncRNA。所得的转录本序列与蒺藜苜蓿同源性高，达到87.87%。. （4）项目共筛选到差异表达基因13,685条，其中上调基因9,421条，下调基因4,264条，呈现出6中不同的表达模式。WGCNA分析共得到与生理生化指标相关联的12个模块，其中模块MEbrown的1964个基因与黄花苜蓿根部的低温应答调控关联性最高。这些基因主要参与Endocytosis、Plant hormone signal transduction、Protein processing in endoplasmic reticulum、Starch and sucrose metabolism和Plant-pathogen interaction等50个代谢通路。