基于信号转导通路网络节点研究何首乌饮干预睾丸组织退行性病变的分子机制

Cellular senescence is core pathological mechanisms causing organ aging ,gonadal hormone secretion disorders, oxidative damage and abnormal lipid metabolism exacerbate the development process of aging. Insulin signal transduction network and signaling pathway is a key link of cellular senescence. Based on the Chinese medical theory that "kidney controlling reproduction" , and the correlation of the profit and loss of kidney essence and gonadal axis and the early research of Heshouwu decoction on antagonising oxidative injury, lipid-lowering, and regulating of cell aging gene expression, this study select the testicular tissue of youth group, natural aging group and Heshouwu decoction preventing aging group as the study object. Aiming at the testicular tissue's aging signal transduction network nodes and signaling pathways of senescence-associated gene regulation, we target IR/IRS,PI3K subunit, AKT subunit the three key node and Sirt1 gene regulative signal ,combine core protein phosphorylation of signal paths and expression changes in midstream and downstream regulatory factors, to discuss the the nature of the testicular cell aging, explore Heshouwu decoction direct or indirect control effect on the insulin signaling pathway and the aging signal, reveal molecular mechanism of Heshouwu decoction to delay testicular tissue aging, make clear "kidney controlling reproduction"'s regulation mechanism of gonad biology, to provide the experimental basis for "notifying kidney and spleen ,promoting blood circulation to remove blood stasis" Heshouwuyin delaying reproductive aging, as well as enrich Chinese medicial Viscera theory scientific meaning of "kidney controlling reproduction"

细胞衰老是机体衰老的核心病理机制，性激素分泌紊乱、氧化损伤和脂质代谢异常加剧了机体衰老发展进程。胰岛素信号转导网络及信号通路是细胞衰老的关键环节。本研究在中医 "肾主生殖"理论的指导下，结合肾精盈亏与性腺轴的相关性，拟在前期何首乌饮抗氧化损伤、降脂和调节细胞衰老基因表达等研究的基础上，选用自然衰老大鼠的睾丸组织为研究对象，针对睾丸组织胰岛素信号转导网络节点及衰老相关基因调控信号通路，以IR/IRS、PI3K亚基、AKT亚基三个关键节点及Sirt1基因调控信号为研究靶标，结合信号通路中核心蛋白的磷酸化以及中、下游调控因子的表达变化，研究睾丸细胞衰老的本质，探究何首乌饮对胰岛素信号转导途径及衰老信号直接或间接的调控作用，揭示何首乌饮延缓生殖衰老的分子机制，明确"肾主生殖"对性腺生物学调控作用机理，为"补肾健脾、活血化瘀"之何首乌饮延缓睾丸衰老提供实验依据，丰富"肾主生殖"中医藏象理论科学内涵。

细胞衰老是机体衰老的核心病理机制，性激素分泌紊乱加剧了机体衰老发展进程。胰岛素信号转导网络及信号通路是细胞衰老的关键环节。本研究在中医 “肾主生殖”理论的指导下，结合肾精盈亏与性腺轴的相关性，针对睾丸组织胰岛素信号转导网络节点，探究何首乌饮对睾丸生精功能的作用及胰岛素信号转导途径机制。本研究以青年组（12月龄）、自然衰老组（18月龄）、何首乌饮干预60 d 组（18月龄）大鼠为研究对象。首先我们采用荧光免疫法观察了睾丸形成的精子质量，证明何首乌饮能够通过改善附睾尾精子质膜完整性、线粒体功能和DNA完整性，提高精子质量。精子质量受激素、基因、细胞因子等多种因素调控。我们采用荧光免疫、化学发光、Western blot进一步研究了睾酮及其分泌关键蛋白StAR 和 P450scc在睾丸间质细胞的表达，结果发现何首乌饮通过提高睾丸间质细胞StAR 和 P450scc蛋白的表达，促进睾酮的合成。同时，我们以青年组、自然衰老组、何首乌饮干预组大鼠睾丸组织RNA为探针，进行基因芯片杂交，筛选出受何首乌饮调控与胰岛素信号网络有关的基因20多个。从中选取关键基因IGF1、IR、IRS1、IRS2、Pik3cd、Rictor、HK1、GSY2和SOCS3进行Real-time PCR验证，结果均证明何首乌饮能上调IGF1、IR、IRS1、IRS2、Pik3cd、Rictor、HK1基因；下调SOCS3和GSY2基因。我们应用荧光免疫和Western blot法研究了IGF1、IR、IRS1、IRS2蛋白在睾丸组织的表达，结果证明IGF1表达在间质细胞、支持细胞、精原细胞和精母细胞的胞质；IR表达在间质细胞、内皮细胞的胞质和胞膜；IRS1表达在支持细胞，次级精母细胞，肌样细胞的细胞膜；IRS2表达在精原细胞，精母细胞，间质细胞的胞膜和胞质。通过半定量分析表明，何首乌饮能够提高IGF1、IR、IRS1、IRS2蛋白的表达，与基因芯片筛查及Real-time PCR结果一致。本课题证明了何首乌饮具有调节精子质量，提高生殖功能的重要功效；明确了“肾主生殖”对性腺生物学调控作用部分机理，为“补肾健脾、活血化瘀”之何首乌饮延缓睾丸衰老提供实验依据，丰富“肾主生殖”中医藏象理论科学内涵；为深入探讨“肾主生殖”中医藏象理论奠定了坚实基础。