花生晚斑病抗性相关基因的定位、克隆与功能分析

Plant diseases are the important factors restraining yield in peanut. Particularly，late leaf spot is a universal disease and also widely spread in our country. Multiple fungicide applications are required to control late leaf spot disease. But the incorrect use of chemical pesticides will cause a series of environmental and social problems. The most economical and environmental friendly strategy is to breed peanut varieties resistant to late leaf spot disease. Development of a new cultivar is time consuming process using the conventional breeding approach. Therefore, it is necessary to accelerate breeding process by molecular technology through understanding the mechanism of resistance to late leaf spot, cloning the resistance genes, and studying the gene function. Up to date, there have been no reports of resistance genes to late leaf spot in peanuts. The aims of this proposed project are to construct a fine map of candidate loci by using MutMap, and study the function of the candidate new genes including Aradu.E8BQZ and Aradu.FM9NQ by gene-editing through CRISPR/Cas9 technology. We will use the F2 segregating population derived from a cross of Yuanza9102 and its mutant M14 as plant materials. Yuanza9102 is resistant to late leaf spot while M14 is highly susceptible. Outcomes of this proposed project would provide an informative and useful references to peanut research community for molecular breeding of late leaf spot resistance.

病害是花生减产的重要因素之一，其中晚斑病是花生生长期普遍发生的世界性病害，在我国也广泛发生。应用杀菌剂是田间防治晚斑病的重要措施，但化学农药的不合理使用会引起一系列环境和社会问题。最经济及环保的措施是培育抗晚斑病的花生品种，然而常规品种培育周期较长。因此，深入阐明花生晚斑病的抗性机制，克隆抗性基因并验证功能，对于加速抗病品种的分子育种进程是非常有必要的。迄今为止，花生中还没有抗晚斑病相关基因的报道。本项目拟以花生品种远杂9102及其化学诱变获得的高感晚斑病的突变体M14构建的F2遗传分离群体为材料，一方面利用MutMap技术对候选位点进行精细定位；另一方面，利用CRISPR/Cas9基因编辑等方法对申请者前期已经获得的两个抗晚斑病候选基因Aradu.E8BQZ和Aradu.FM9NQ及新定位的基因进行功能验证。研究结果将为花生晚斑病抗性分子育种提供重要参考。

花生是世界上最受欢迎和消费最多的油料作物之一，为人们提供了高品质的食用植物油和优质的蛋白资源，但花生生产也面临着一些严峻的问题，晚期叶斑病（LLS）、早期叶斑病（ELS）和网斑病（WB）等病害时有发生，对花生产量和品质造成了严重影响。使用化学杀虫剂控制这些病害会增加生产成本并对环境产生破坏，最经济和环保的方法是培育和推广抗病花生品种，但抗病基因的鉴定及其功能研究甚少，影响了利用现代生物技术手段培育抗病品种的进程。本项目利用高抗晚斑病的突变体m14与其野生型对照远杂9102为材料，通过MutMap技术将候选基因初定位在4号染色体约15.8Mb的区间内，然后通过BSR分析，进一步缩小候选区间，发现编码NPR3(Nonexpresser of PR genes)的基因在外显子上存在一个G到A的突变，该点突变导致AhNPR3A的C端转录激活结构域内的Gly转变为Arg，引起花生WRKY基因和部分病程相关蛋白基因的上调表达。晚斑病菌接种试验也表明，该突变会导致m14叶斑病抗性增强，这一研究结论为进一步揭示花生抗病的分子机制奠定了基础，除此之外，还通过对接种晚斑病的材料进行转录组测序，另获得晚斑病抗性相关基因7个，有助于进一步解析AhNPR3参与的系统获得性抗性（SAR）机制调控网络。随后，本项目运用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得AhNPR3A基因以及前期通过QTL定位获得的LLS叶斑病抗性基因的早代基因编辑株系，为后续抗性机制研究提供了重要材料基础。本项目还鉴定了25个 AhMlo 位点，发现含有其中两个位点的免疫负调节因子可能是花生品种易感病的特异基因，对于抗病性研究具有重要价值。同时还利用转录组测序和基因组重测序技术，分别获得早斑病和网斑病抗性相关的候选基因19个和40个。此外，本项目还对在植物生长发育和应对各种胁迫中发挥着重要作用的185个花生AP2/ERF转录因子进行了鉴定和分析，为进一步鉴定响应外界胁迫的候选基因奠定了重要基础。