饮用水贫营养条件下细菌可培养性转化的多因子诱导作用研究

Usually the bacterial amounts in drinking water are determined through using plate counting method which is dependent on culturing the bacteria in artificial media. However, the occurrence of viable but non-culturable (VBNC) state will result in significant underestimation of alive bacteria numbers and thus severe health risks. In this study, the concept of VBNC is extended to the transformation of bacterial culturability. It is supposed that this transformation is in gradient with key nodes connecting the interim states. In addition, this transformation could be induced by a mode of "1+x", i.e. the oligotrophic condition plus one or more other factors including low temperature, disinfection and biofilm, simultaneously or in sequence. The following will be investigated: (1) The methods characterizing the bacteria with different culturabilities qualitatively and quantitatively; (2) How is the culturability transformed and the subsequent metabolic, physiological and genetic activities; (3) the resuscitation from the states with injured or lost culturability and the impact factors. Hopefully this study will clarify the drawbacks and potential risks of the culturing method in determining bacterial numbers in drinking water. Novel scientific basis is also expected to promote the development of more suitable bacterial detection method and more efficient disinfection technology.

培养法是国际通用的饮用水细菌学指标检测方法,然而细菌“有活性但不可培养(VBNC)”状态的存在将使该方法低估饮用水中活细菌的数量,进而造成严重的健康风险。本项目将“VBNC状态”的概念外延至“细菌可培养性的转化”,提出饮用水中这一转化是由关键节点和过渡区间组成的渐变过程的假设,以及这一转变的1+x多因子诱导模式(贫营养和低温、消毒、生物膜内部的不利条件等一种/几种其它因素同时/顺序作用)。本项目将主要研究细菌不同可培养状态的定性定量表征方法及其实际验证,细菌被诱导后可培养性转化及活性变化规律,以及可培养性下降/丢失后的恢复及影响条件等。通过上述研究,希望能明晰培养法在饮用水细菌学指标评价中的缺陷和可能风险,进而为更全面的理解饮用水生物安全性的复杂性、开发更合适的细菌检测方法和更高效的消毒工艺提供科学依据。

本项目围绕着饮用水条件下细菌可培养性的变化及其机理这一主线，主要开展了以下工作：.（1）氯和氯胺消毒后，随消毒剂浓度增加，E.coli渐渐丧失可培养性，直至部分细胞进入VBNC状态赋存在饮用水管网系统中；在实际的生产规模工艺中，经过氯作用后的出厂水中，仍能检测到101-102 cells/100 mL 的VBNC状态条件致病菌，其在出水中的浓度与其在活性炭生物膜上的浓度呈现正相关关系；.（2）VBNC细菌的存在导致平板计数法对活性菌数量严重低估，其定量测定可采用CTC染色结合流式细胞仪的方法；活性表征可以重水标记单细胞拉曼光谱方法进行；从KEGG分析，E. coli可培养性改变源于其ATP与核酸合成减少，最终失去可培养性；.（3）氯和氯胺作用后，VBNC状态E.coli形态会变弯曲，长度也会变短；作用过程中E.coli的呼吸和代谢活性逐渐降低，但即便在高剂量下，仍有低水平的呼吸活性； VBNC状态细菌部分致病基因仍能表达，超氧化物调节子基因和参与合成过氧化氢酶基因均显著上调；应激因子rpoS基因表达的显著上调，结果表现为 VBNC状态细菌环境耐受性增强；.（4）VBNC状态细菌对多种抗生素的耐受性大幅增强，并具有非特异性和广谱性； 其原因在于VBNC细菌外排泵相关基因显著上调；生长和代谢相关基因显著下调； .（5）UV消毒可以诱导环境中机会致病菌和模式菌株进入VBNC状态；但即使在较高的UV剂量下，其呼吸活性保持在较高水平，群体呼吸强度符合标准正态分布；其代谢活性会随着UV剂量增加减弱，且具有种水平异质性。..通过上述研究，证实了细菌常规检测方法在评价饮用水生物安全中的缺陷与可能风险，并构建了饮用水中细菌评价的系统方法学体系，解释了细菌可培养性变化发生和过程及其内在机理，为饮用水安全评价和更为高效安全的消毒工艺的研发提供了科学依据。