抗氟吗啉的辣椒疫霉中cesA3基因表达和功能研究

目前羧酸氨基类（CAA）杀菌剂是国际杀菌剂领域的研究热点，但其抗药性机制和作用机理尚无明确。氟吗啉是我国第一个具有独立知识产权且商品化的杀菌剂，属于CAA类杀菌剂中的肉桂酰胺类，虽已在中国、美国和欧洲申请了发明专利，但由于其作用机理及其抗药性的相关研究远远滞后于生产应用，直接影响和阻碍了该创制性杀菌剂的国际认知度及系列衍生物的开发。申请者于2007年在国家自然基金支持下完成了氟吗啉抗性相关基因的克隆，取得了突破性进展。本项目拟在此基础上，建立高效稳定的卵菌转化体系，进一步完成cesA3基因的表达及其在抗药性产生中的功能研究，以明确病原菌对氟吗啉的抗药性分子机制和药剂作用靶标位点。以上研究结果将为卵菌分子生物学研究提供必要的技术支持，有望填补肉桂酰胺类杀菌剂抗药性和药理学研究领域的空白，并对建立我国创制性杀菌剂抗药性研究体系提供借鉴，对指导该杀菌剂的科学使用和延缓抗药性的产生具有重要意义。

本项目通过同源扩增的方法从辣椒疫霉中鉴定出4个纤维素合酶基因，明确了辣椒疫霉不同发育阶段4个纤维素合酶基因的表达量存在明显差异，其中CesA3和CesA1具有重要的功能。并利用生物信息学的方法分析了4个纤维素合酶的分子特征，预测了辣椒疫霉中的四个纤维素合酶的功能，明确了CesA3在纤维素合成过程中可能具有独特的功能；通过遗传学的方法证实PcCesA3上1073、1105、1109位的SNP与辣椒疫霉对氟吗啉的抗性相连锁，同时证实了辣椒疫霉对CAA类杀菌剂的抗性由单个不完全显性基因控制；. 获得5种不同类型的抗性突变体，分析了不同突变类型的抗性菌株对CAA类杀菌剂的抗性水平，明确不同类型突变体对氟吗啉敏感性的变化规律；同时明确了CesA3蛋白上CAA类杀菌剂的结合腔的位置，位于CesA3蛋白C端最后两个跨膜域之间。综合推测不同的CAA类杀菌剂与CesA3结合的具体位点可能存在差异；通过测定杂合突变体中CesA3的表达量及其等位基因的表达比例，结果表明CesA3上游的插入片段可能引起药剂选择压下等位基因表达水平的差异，从而影响杂合突变体对CAA类杀菌剂的抗性水平；. 以同位素标记的方法测定了CAA类杀菌剂对辣椒疫霉纤维素合成的影响，结果表明氟吗啉可以抑制菌丝生长阶段和休止孢萌发阶段的纤维素合成。结合抗药性机制，确定氟吗啉的作用靶标可能是CesA3基因。同时，制备辣椒疫霉纤维素合酶的多克隆抗体，通过免疫胶体金的方法，明确辣椒疫霉中纤维素合酶主要分布在细胞膜上；建立了PEG-CaCl2介导的辣椒疫霉转化方法，构建了CesA3-gfp融合表达载体。采用农杆菌介导以及电击转化的方法转化验证CesA3基因上点突变的功能，获得一定数量的转化子，其对氟吗啉的敏感性出现不同程度的下降。确定CesA3基因突变是否是引起辣椒疫霉对氟吗啉产生抗药性的主要原因。. 通过上述研究明确病原菌对氟吗啉的抗药性分子机制和药剂作用靶标位点，研究结果将为卵菌分子生物学研究提供重要参考，对指导该杀菌剂的科学使用和延缓抗药性的产生具有重要意义。