分子聚集诱导发光效应在胶原酶合成底物设计上的引入与机制研究

胶原酶在医药卫生、食品工业及皮革制造上具有重要用途，因此克服胶原酶分析费时费力、合成底物工作量大、成本高等缺陷，努力实现胶原酶高通量、高灵敏度的快速筛选成为生物分析研究人员孜孜不倦的追求。最近几年，分子聚集诱导发光效应作为一种新型发光机制在生物分析上展现出广大前景。本申请基于胶原酶水解底物与四苯乙烯季铵盐之间静电与疏水作用能促进分子聚集导致荧光增强的原理,将分子聚集诱导发光效应引入胶原酶合成底物设计。利用荧光光谱与动态光散射检测技术,创建一种合成量小、响应时间快、信号灵敏度高的胶原酶分析方法。本申请还拟借助液相色谱-串联质谱联用技术与圆二色谱，对胶原酶的作用机制进行研究。分子聚集诱导发光效应在胶原酶合成底物上的成功引入与机制研究，不仅是对胶原酶合成底物体系开拓性的探索，也必将对其他蛋白酶底物设计提供借鉴作用。

胶原酶在医药卫生、食品工业及皮革制造业上具有重要用途。实现对胶原酶的高通量、高灵敏度筛选分析是相关领域的关注目标。近年来，分子聚集诱导发光效应作为一种新型发光机制被应用于糖类、蛋白、DNA等分析，在生物传感上展现了广大前景。本项目研究主要是将分子聚集诱导发光效应引入胶原酶筛选中，建立一种新型的胶原酶分析方法。主要执行工作陈述如下：.1. 借助Suzuki反应和 McMurry反应，合成了基于四苯乙烯结构的系列分子，完成纯化与结构表征。.2. 使用化学与生物方法制备了不同的胶原酶底物，用于胶原酶分析：（1）通过固相化学合成获得含有胶原三肽结构的蛋白肽；（2）利用蛋白酶水解三文鱼鱼皮获得鱼皮胶原蛋白提取物；（3）在基因挖矿技术筛选获得类人胶原蛋白基因后，通过构建酵母工程菌进行高密度发酵制备了重组类人胶原蛋白。.3. 通过传统方式筛选到一株有胶原酶活性的蜡样芽孢杆菌，由于在分离纯化中发现该菌株的胶原酶容易失活，因此改用基因挖矿、序列比对、异源表达的方法对来源于蜡样芽孢杆菌的胶原酶进行鉴定纯化与制备。.4. 利用胶原酶对不同胶原底物进行水解，对相应体系水解前后加入四苯乙烯季铵盐的荧光变化进行测试，结合高效液相色谱与质谱对胶原酶水解体系产物的分析，探讨了使用四苯乙烯季铵盐，借助分子聚集诱导荧光现象用于胶原酶筛选分析的实验条件以及实现检测的关键因素。.上述研究发现四苯乙烯季铵盐用于分析检测原理的静电吸引作用与疏水作用对不同胶原酶底物的作用条件及适应局限性不同。合成肽水解后产生的羧基端数目有限，静电吸引弱，需要考虑增强疏水作用；鱼皮胶原蛋白提取物或重组类人胶原蛋白的水解产物带大量电荷，然而其良好的水溶性可能使四苯乙烯季铵盐被肽段内包裹，导致无检测信号输出。为解决上述问题，引入络合竞争作用的概念，使用含有（2-吡啶甲基）胺基的四苯乙烯分子，通过其配位基团与水解后重组类人胶原对金属离子Cu2+的络合竞争，进行了以重组类人胶原为底物的胶原酶水解分析，发现络合竞争作用能够调节分子聚集诱导荧光效应，可用于检测胶原酶的四苯乙烯探针分子设计。此外，借助圆二色谱与动态光散射仪监控了胶原酶水解过程中的底物结构变化与四苯乙烯分子粒径尺寸变化，以辅助说明四苯乙烯分子用于胶原酶筛选中出现的实验现象。本项目探索了四苯乙烯分子在胶原酶分析中的作用机制，为分子聚集诱导荧光效应在胶原酶分析中的应用提供了指导意见