难治性癫痫发病及耐药机制中关键蛋白分子的筛选和功能研究

我国约有900万癫痫患者，其中1/3为难治性癫痫。难治性癫痫的发生及耐药机制还不清楚，治疗缺乏有效的手段。生命是一个极其庞大和复杂的动态网络系统，蛋白质组学技术能从整体水平上对许多生物医学问题获得更为全面的认识。.我们已收集难治性癫痫脑脊液及病灶脑组织30余例，并成功建立了马桑内酯点燃恒河猴颞叶癫痫耐药模型，因此，在前期工作的基础上，本课题拟利用蛋白质组学技术的优势，采用iTRAQ、DIGE、生物质谱等多种先进的蛋白质组学方法，在灵长类动物模型及人群等两个不同层次，对与难治性癫痫发病及耐药相关的蛋白进行较大规模的筛选。并进一步应用免疫印迹、RNA干扰等分子生物学方法对可能的疾病相关蛋白进行功能学研究。.本研究将有助于揭示难治性癫痫的发病及耐药机理，并为癫痫的治疗提供新的作用靶点。

目的：利用灵长类动物恒河猴颞叶癫痫耐药模型，通过蛋白质的差异表达谱及功能蛋白组学研究，筛选与颞叶难治性癫痫发病及耐药有关的关键分子，为确定颞叶难治性癫痫的早期诊断指标和新的治疗靶点提供理论和实践基础。.方法：1）利用口服给药观察行为学的方法及电镜观察超微结构的方法对马桑内酯点燃的恒河猴癫痫模型进行了进一步的证明；2）利用免疫组织化学的方法对目前已知的多个耐药相关蛋白(包括MRP-1和GST-Pi)进行研究，比较了这些指标在正常恒河猴及马桑内酯点燃恒河猴模型的海马组织、颞叶组织、丘脑、纹状体以及脊髓各个不同脑结构中的表达。3）利用最新的蛋白质组定量技术iTRAQ对难治性癫痫发病机制在灵长类动物层次进行了新的探索；4）利用生物信息学技术对47个差异蛋白进行了系统分析，Gene Ontology分析包括蛋白参与的生物过程、所处的细胞位置、发挥的分子功能三方面功能信息，另外还系统进行了pathway分析及蛋白作用的gene network分析；5）利用免疫组织化学的方法对成功鉴定的hub蛋白（核心蛋白）GFAP进行了进一步的验证。.结果：丙戊酸钠（Valproate）和卡马西平（Carbamazepine）均不能有效的抑制马桑内酯引起的此模型动物癫痫发作，然而，新型抗癫痫药（Levetiracetam）和唑尼沙胺（Zonisamide）对该癫痫发作具有显著的抑制作用。电镜结果显示恒河猴颞叶癫痫海马组织线粒体肿胀、脊断裂、空泡变、粗面内质网正常溶酶体增多。在点燃模型的海马组织中，耐药相关蛋白MRP-1和GST-Pi的表达较正常对照组均有明显的上调。蛋白质组学方法筛选出恒河猴颞叶癫痫海马组织与正常对照组织差异蛋白47个，差异蛋白参加的生物学过程包括细胞循环和增值、应激反应、转运、蛋白及其它代谢过程、发育、细胞间的信号传递、胞内信号转导、细胞死亡等；细胞的位置主要是细胞器的膜及线粒体；分子功能除细胞骨架外，主要是信号转导及转运功能。网络连接度分析提示网络中连接度高的基因有NCAM1和GFAP。进一步免疫组织化学研究成功验证了GFAP在模型组显著增多。.结论：马桑内酯点燃的恒河猴癫痫模型的超微结构与人类癫痫具有相似性，对传统抗癫痫药物不反应及有多种耐药相关蛋白表达上调，从而表现为耐药模型;这些差异蛋白有助于揭示难治性癫痫的发病及耐药机理，并为癫痫的治疗提供新的作用靶点。