儿童侵袭性CA-MRSA ST59克隆PSMα毒力因子对Hlα调控机制的研究

The exact pathogenesis of invasive community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) enhanced virulence is unclear, previous research reported that it was strongly associated with the increased expression of virulence determinants: α-helical phenol-soluble modulin (PSMα) and alpha-toxin（Hla）. Regional differences exist in the distribution of CA-MRSA clones，and the virulence varies with different clonal lineages. We previously found that the most predominant sequence type（ST）of CA-MRSA was ST59 in Chinese children, which harbored virulence genes above. This study is focus on PSMα regulates Hla produttion through global regulatory genes agr. We compare their expression to their deletions to confirm the differential expression of virulence determinants in skin and soft tissue infection, pneumonia, bacteriaemia animal models. And then we can elucidate α-helical phenol-soluble modulin regulates alpha-toxin produttion through global regulatory factor AgrA and discuss the basis for research in clinical prevention and diagnosis.

社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)在我国儿童侵袭性MRSA感染中逐渐增多。ST59克隆是我国儿童CA-MRSA的主要流行克隆，目前其毒力增强的确切机制尚不清楚。研究发现受Agr调控系统调节的酚溶调制肽（PSMα）和a-溶血素（Hla）与其毒力增加有密切关系，且近期发现PSMα、Hla两种毒力因子间具有协同作用。我们前期发现我国儿童ST59克隆携带特定毒素基因，包括psmα和hla基因。本课题拟对我国儿童ST59克隆代表株中PSMα对Hla调控的可能机制进行研究。通过对相关基因进行敲除及增强表达，将相应菌株接种于皮肤软组织脓肿、肺炎、菌血症实验动物模型，比较其致病力，同时利用人类中性粒细胞溶解实验分析其抵抗宿主固有防御能力，分析PSMα、Hla、agrA三者间相关性；试明确PSMα是通过AgrA通路对Hla产生影响，探讨ST59克隆毒力因子PSMα、Hla相互影响机制。

社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA-MRSA）在我国儿童MRSA感染中逐渐增多。研究发现受附属基因调节系统（agr系统）调节的酚溶调制肽（PSMα）和α-溶血素（Hlα）与其毒力增加密切相关，且近期发现psmα对hlα具有调控作用。本课题拟研究我国儿童MRSA临床分离株分子分型及耐药性特征及变迁，并筛选出CA-MRSA主要流行克隆代表株，对psmα、hlα、agr进行敲除并对psmα、hlα进行增强表达，进而采用高通量转录组测序研究psmα基因敲除对菌株整体转录组的影响，深入研究其对hlα调控作用的可能机制，最后通过红细胞溶解实验及皮肤软组织感染、菌血症动物模型研究相关毒力基因对菌株致病力的影响。主要研究结果如下：（1）MRSA临床分离株具有较高同源性，生物膜形成能力强、多重耐药率高的ST59-SCCmec IV-t437-agr I克隆为HA-MRSA和CA-MRSA主要流行克隆；传统HA-MRSA ST239-SCCmec III分离株逐渐减少且对多种抗生素耐药性下降，CA-MRSA的优势克隆和耐药性在2010-2017年保持稳定；MRSA对万古霉素MIC值出现爬升。（2）psmα敲除可使ST59-SCCmec IV克隆的转录组发生变化，筛选出差异基因27个（上调13个，下调14个），差异基因涉及多种生物学过程及信号通路。（3）对psmα、hlα、agr基因修饰未影响菌株的生长状况；psmα敲除后，RNAIII（agr系统主要效应分子）表达下降，hlα转录和翻译水平均下降；agr敲除后，psmα基本不表达，hlα表达下降；hlα敲除后，psmα表达下降，RNAIII转录水平无显著变化；hlα过表达后，RNAIII和psmα转录水平均增加；通过红细胞溶解实验及感染动物模型显示，psmα、hlα、agr敲除株的致病力明显降低，hlα过表达后菌株的致病力显著增强。以上结果表明生物膜形成能力强、多重耐药率高的ST59-SCCmec IV-t437-agr I克隆已成为我国儿童MRSA的主要流行克隆，psmα参与调控MRSA ST59克隆多种生物学过程及信号通路，psmα可通过反向作用于agr系统调控hlα基因的表达。该研究加深了人们对我国儿童金葡菌临床分离株分子特征、耐药性及毒力调控系统的认识，为金葡菌感染的防控及新型抗感染药物的研发提供理论依据。